基因重組-生物合成概念(參考版)
2024-08-15 15:14本頁面
【正文】 由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了?！ ±胮BR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個經(jīng)常提到的應用例子。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。然后，將混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體?！ ⑺救~綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。 pBR322的應用 了解了pBR322的結構和它的構建過程之后，我們來看pBR322在基因工程中的應用?！ 〈撕笪覀儽謨陕罚阂宦钒裵BR313的PstI位點除去，使之成為ampstetr表型的pBR318質(zhì)粒； 5；另一路把pBR313的EcoRII的位點切除，使之成為amprtets表形的pBR320質(zhì)粒。 pBR322質(zhì)粒載體的構建 pBR322質(zhì)粒載體的構建過程可簡單地概括如下： 由于pBR322質(zhì)粒的親本之一是pMB1質(zhì)粒，故首先以pMB1為基礎，引入Rldrd19質(zhì)粒的Tn3易位子，； pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體，所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去，留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來后就形成了pMB8質(zhì)粒（）； 此時，另外一種pSC101質(zhì)粒在EcoRI活性條件下消化產(chǎn)生了含有tetr抗性的DNA片斷，這個片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB9質(zhì)粒（）。很顯然，既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個標記基因。當把這種重組DNA分子轉(zhuǎn)到宿主細胞后，該基因原來賦予的表型也就消失了。標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細胞。經(jīng)驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識別位點位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。現(xiàn)在已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限制酶的單一識別位點。這種質(zhì)粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因?！ ?973年，科學家將質(zhì)粒作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。常用的人工質(zhì)粒運載體有pBR32pSC101。
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