dna重組技術(參考版)
2024-08-15 13:27本頁面
【正文】 C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質生物功能測定法C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質生物結構鑒定法 放射免疫原位雜交 鑒定： 影印用固定了特異性抗體的 聚乙烯薄膜 影印洗滌與 I125標記的 IgG保溫感光輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 與 I125標記的 IgG保溫洗滌、干燥、感光 用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌體噴灑 克隆平板 含抗體的聚乙烯膜 裂解平板 C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質生物結構鑒定法 免疫沉淀 鑒定： 在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標蛋白的特異性抗體 然后涂布轉化液 37℃ 培養(yǎng) 經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落變會分泌出目標 蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀 反應，在菌落周圍形成白色的圓斑 此法簡便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大 C外源基因產(chǎn)物檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳法 如果待篩選鑒定的目標蛋白既不能測定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可采用 聚丙烯酰胺凝膠電泳進行粗略的篩選。 缺點： 較煩瑣。 分離的基因編碼著豐富的 mRNA。如果此時轉化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落，即可認為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質生物功能測定法 抗菌素抗性基因的鑒定： 目的重組子 誘導抗性 抽取重組質粒再次轉化C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質生物功能測定法 DNA結合蛋白編碼基因的鑒定： 影印用 聚乙烯薄膜 影印裂解平板 洗滌雜交感光輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 80℃ 烘干固定影印薄膜 與探針溶液中雜交 洗滌、干燥、感光 用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌體噴灑 克隆平板 聚乙烯膜探針選用能與 目標蛋白特異 性結合的 DNA 片段 該方法用于 cDNA文庫中目的基因的篩選。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進行鑒定C外源基因產(chǎn)物檢測蛋白質生物功能測定法 抗菌素抗性基因的鑒定： 抗菌素抗性基因表達的蛋白質能使受體細胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性。因此， 目的重組子 菌落周圍會形成透明圈。將難溶的淀粉加入固體培養(yǎng)基內，培養(yǎng)基呈混濁狀。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸的單鏈 DNA， 從而讀取 DNA的核苷酸序列。用 HindIII和 EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及 SphI的 1 / 50 B克隆 DNA序列檢測限制性酶切圖譜法 全酶解圖譜法：pUC18 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZ’oriB BE P kb kb kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子用 EcoRI酶切轉化子質粒 DNA目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb用 PstI酶切轉化子質粒 DNA目的重組子： kb + kb 或者： kb + kbB克隆 DNA序列檢測限制性酶切圖譜法 全酶解圖譜法：pUC18 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZ’oriB BE kb kb kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子對圖示的克隆片段，轉化子質粒DNA用 EcoRI酶切開后，只出現(xiàn) kb和 kb兩條帶子，實際上 kb的條帶中含有兩種不同的分子 kb kbEB克隆 DNA序列檢測限制性酶切圖譜法 部分酶解圖譜法： kbPstI EcoRI BamHIBBE kb kbEB 該重組質粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)：BamHI全酶解： kbBamHI+EcoRI全酶解： kb其中， kb片段的存在表明該片段位于一端BamHI部分酶解： kb其中， kb的片段必為 kb和 kb兩片段，表明兩者是連在一起的；同理， kb的片段必為 kb和 kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后， kb的片段必為 kb和 kb兩片段，表明兩者是連在一起的B克隆 DNA序列檢測菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或 DNA片段的 同源序列 設計并合成 探針 ，以此搜尋篩選含有目的基因的 目的重組子 。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應）等A載體遺傳標記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本操作： pUC18AprlacZ39。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉化子 A載體遺傳標記檢測營養(yǎng)缺陷型篩選法 常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記： 哺乳動物細胞中存在兩條 dTTP的
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