用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理(參考版)
2025-07-10 16:12本頁面
【正文】 總之，SNP芯片已經(jīng)，并將繼續(xù)被用于生命科學(xué)研究及實(shí)踐，其高效、高通量的優(yōu)點(diǎn)必將使它在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、中藥學(xué)、遺傳學(xué)、司法等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在人類探索自身生命奧秘的進(jìn)程中發(fā)揮舉足輕重的作用。當(dāng)一個(gè)人的基因組DNA經(jīng)過抽提、PCR標(biāo)記和雜交以后會得出各個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)就代表了一個(gè)人的身份。SNP芯片目前已被用于這些多態(tài)性的鑒別，以期制作個(gè)人鑒別的“基因身份證”。因此芯片技術(shù)對藥物基因組學(xué)研究影響重大［19］。藥物遺傳學(xué)的研究模式通常是通過基因組測序發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性，如SNP,然后進(jìn)行藥理和毒理學(xué)研究，檢測其對臨床藥物反應(yīng)多態(tài)性的影響。隨著人類基因組計(jì)劃和后基因組計(jì)劃的開展越來越多的與遺傳病相關(guān)的基因被揭示出來，基因突變檢測技術(shù)已得到了快速發(fā)展，成為診斷多種遺傳病的常規(guī)手段［18］。遺傳性疾病的基因診斷是采用分子生物學(xué)的方法在DNA和RNA水平上對某一疾病的相關(guān)基因進(jìn)行分析，從而對特定的疾病進(jìn)行診斷。該方法較蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片簡單，只需單一熒光標(biāo)記，不需主動(dòng)雜交，但是假陽性率得不到保證，而且不適用于新的SNP位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。DNA結(jié)合反應(yīng)原理的SNP芯片除了DNA和蛋白相互作用外，Goto等［17］用熒光分子丫啶酯對錯(cuò)配DNA進(jìn)行檢測以分析點(diǎn)突變的SNP芯片方案，又稱為雜交保護(hù)機(jī)制（HPA）。目前所用的大多數(shù)基于芯片的SNP檢測方法只能適用于已知突變的檢測， 但是Muts法對這些技術(shù)進(jìn)行了補(bǔ)充，由于該方法基于錯(cuò)配原理而且對于突變位點(diǎn)在探針中的位置和探針長度的要求不像其他芯片那樣苛刻，因而適合于新的SNP位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。該法原理和操作簡單，酶切特異性強(qiáng)，但是由于酶切可能不完全，所以假陽性率較高。其步驟是直接將末端標(biāo)記的PCR產(chǎn)物固定在BMPS上，限制性酶切后檢測熒光強(qiáng)度值。常用的酶還有熱穩(wěn)定性DNA連接酶，因?yàn)樗芨咛禺愋缘貦z測DNA堿基改變，并在較大的溫度范圍內(nèi)都有活性［14］。在該方法中，等位基因的可變堿基設(shè)計(jì)在探針3′末端，與靶序列的可變形式對應(yīng)。這種在芯片平臺上進(jìn)行的多重PCR固相擴(kuò)增反應(yīng)為SNP檢測提供了一個(gè)有力的工具，避免了芯片外繁瑣的液相PCR制備靶標(biāo)的步驟，大大提高了芯片檢測的效率，該方法在診斷和大規(guī)模的基因分型中具有很好的應(yīng)用前景［12］?！耙徊椒ā狈磻?yīng)原理的SNP芯片雖然芯片篩選的最大特點(diǎn)是高通量，但無論是單堿基延伸反應(yīng)還是等位基因特異性引物延伸反應(yīng)均需要靶標(biāo)的擴(kuò)增、制備和純化等步驟，從而使大規(guī)模的基因分型工作費(fèi)時(shí)耗力。該方法能真實(shí)反映出轉(zhuǎn)錄后的基因序列中的單個(gè)位點(diǎn)的等位基因的情況，對于研究基因轉(zhuǎn)錄過程有一定的幫助［10］。反轉(zhuǎn)錄酶在DNARNA雙螺旋中區(qū)別終端錯(cuò)配的能力也被用于提高芯片上單核苷酸多態(tài)性分型的精確性。在該酶介導(dǎo)的等位基因特異性延伸反應(yīng)中利用了錯(cuò)配引物和完全匹配引物延伸反應(yīng)中的動(dòng)力學(xué)差異，完全匹配引物的反應(yīng)速度較快，能夠在酶切之前完成引物鏈的延伸，而錯(cuò)配引物速度很慢，引物延伸速度小于降解速度，最后被完全消化。其缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)，假陽性率較SBE高［8］。它的原理與SBE大致相同，但是引物的3′端為SNP位點(diǎn)，且用以擴(kuò)增的是dNTP而非ddNTP，因此引物末端延長的并非單個(gè)堿基，而是與靶標(biāo)互補(bǔ)的核苷酸序列［7］。圖2SBETAGS檢測SNP基因型Fig. 2SNP genotyping by SBETAGS(a): SBETAGS dual primers。由于對應(yīng)于每一個(gè)位點(diǎn)都有一個(gè)不同的標(biāo)簽，基因型的檢測反應(yīng)能夠以一個(gè)多重形式進(jìn)行，通過引物上的標(biāo)簽和固定在芯片上的互補(bǔ)的標(biāo)簽相結(jié)合，不同位點(diǎn)的目標(biāo)產(chǎn)物能夠在芯片上相分離。 (c): Single base extension catalyzed byDNA polymorphism。圖1單堿基延伸反應(yīng)（SBE）檢測SNP基因型(a): 寡核苷酸引物固定于芯片上； (b): 待測PCR產(chǎn)物與引物堿基配對；(c): DNA聚合酶作用下的單堿基延伸反應(yīng)；(d): 熒光種類的檢測Fig. 1SNP genotyping by single base extension(SBE)(a)：Oligonucleotide primers were immobilized on microarray。2005, 25(11)張小燕 等：用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理中國生物工程雜志 China Biotechnology 2005單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)，又名微測序法(minisequencing),其原理如圖1所示，根據(jù)待檢測樣品的SNP位點(diǎn)5′端序列設(shè)計(jì)引物（不包括SNP位點(diǎn)）并將其直接固定在芯片上，以待測樣品的PCR產(chǎn)物作為模板，加以用各色熒光或者其他標(biāo)記物標(biāo)記的4種ddNTP，在適當(dāng)?shù)臈l件下，在DNA多聚酶的催化下與PCR產(chǎn)物配對的引物直接在芯片上進(jìn)行固相單堿基延伸反應(yīng)，根據(jù)樣本序列中特異的堿
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