用基因芯片檢測單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理-文庫吧
2025-06-22 16:12 本頁面
【正文】 測SNP基因型(a): 寡核苷酸引物固定于芯片上； (b): 待測PCR產(chǎn)物與引物堿基配對；(c): DNA聚合酶作用下的單堿基延伸反應(yīng)；(d): 熒光種類的檢測Fig. 1SNP genotyping by single base extension(SBE)(a)：Oligonucleotide primers were immobilized on microarray。 (b):PCR products and primers paired bases。 (c): Single base extension catalyzed byDNA polymorphism。 (d): Detection of fluorescence 2002年，Hirschhorn等［4］創(chuàng)建的SBETAGS法，原理如圖2所示，在芯片上進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)時(shí)，使用了具有雙重功能的引物，即除了等位基因特異性的序列，還另有一段具有特定序列的標(biāo)簽(tag)。由于對應(yīng)于每一個(gè)位點(diǎn)都有一個(gè)不同的標(biāo)簽，基因型的檢測反應(yīng)能夠以一個(gè)多重形式進(jìn)行，通過引物上的標(biāo)簽和固定在芯片上的互補(bǔ)的標(biāo)簽相結(jié)合，不同位點(diǎn)的目標(biāo)產(chǎn)物能夠在芯片上相分離。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、便宜，而且精確度較SBE高，用此方法對芯片上的100個(gè)SNP位點(diǎn)、5 000多個(gè)基因型進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果證明正確率是99%［5］。圖2SBETAGS檢測SNP基因型Fig. 2SNP genotyping by SBETAGS(a): SBETAGS dual primers。 (b): SBETAGS reaction等位基因特異性引物延伸(allelespecific primer elongation)也是依賴于DNA聚合酶的對錯(cuò)配堿基的敏感性進(jìn)行的［6］。它的原理與SBE大致相同，但是引物的3′端為SNP位點(diǎn)，且用以擴(kuò)增的是dNTP而非ddNTP，因此引物末端延長的并非單個(gè)堿基，而是與靶標(biāo)互補(bǔ)的核苷酸序列［7］。與SBE相比，該方法只需要單色熒光系統(tǒng)，而且熒光信號較強(qiáng)。其缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)，假陽性率較SBE高［8］。為了克服這一缺點(diǎn)，O’meara等［9］將三磷酸腺苷雙磷酸酶引入到等位基因特異性延伸反應(yīng)中以控制反應(yīng)特異性。在該酶介導(dǎo)的等位基因特異性延伸反應(yīng)中利用了錯(cuò)配引物和完全匹配引物延伸反應(yīng)中的動(dòng)力學(xué)差異，完全匹配引物的反應(yīng)速度較快，能夠在酶切之前完成引物鏈的延伸，而錯(cuò)配引物速度很慢，引物延伸速度小于降解速度，最后被完全消化。該方法克服了假陽性高的缺點(diǎn),適合于精確有效的大規(guī)?；蚍中?。反轉(zhuǎn)錄酶在DNARNA雙螺旋中區(qū)別終端錯(cuò)配的能力也被用于提高芯片上單核苷酸多態(tài)性分型的精確性。其分辨原理基于由反轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的等位基因特異性引物沿著RNA靶標(biāo)延伸反應(yīng)的特異性。該方法能真實(shí)反映出轉(zhuǎn)錄后的基因序列中的單個(gè)位點(diǎn)的等位基因的情況，對于研究基因轉(zhuǎn)錄過程有一定的幫助［10］。但是由于其假陽性較高和反應(yīng)條件較苛刻，所以目前研究較少?！耙徊椒ā狈磻?yīng)原理的SNP芯片雖然芯片篩選的最大特點(diǎn)是高通量，但無論是單堿基延伸反應(yīng)還是等位基因特異性引物延伸反應(yīng)均需要靶標(biāo)的擴(kuò)增、制備和純化等步驟，從而使大規(guī)模的基因分型工作費(fèi)時(shí)耗力。Huber等［11］建立了將基因組DNA直接用于基因分型“一步法”芯片系統(tǒng)，所謂“一步法”，即將用于制備分型靶標(biāo)的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)和用于基因分型的等位基因特異性延伸反應(yīng)在芯片平臺上相結(jié)合，使兩者直接在芯片上的單個(gè)反應(yīng)步驟中完成。這種在芯片平臺上進(jìn)行的多重PCR固相擴(kuò)增反應(yīng)為SNP檢測提供了一個(gè)有力的工具，避免了芯片外繁瑣的液相PCR制備靶標(biāo)的步驟，大大提高了芯片檢測的效率，該方法在診斷和大規(guī)模的基因分型中具有很好的應(yīng)用前景［12］。該方法與雜交延伸相似，不同之處在于，它利用T4噬菌體DNA連接酶連接DNA切口，以及粘性末端在探針末端連接上特殊設(shè)計(jì)的且與樣品DNA中SNP位點(diǎn)下游片段完全互補(bǔ)的熒光標(biāo)記探針［13］。在該方法中，等位基因的可變堿基設(shè)計(jì)在探針3′末端，與靶序列的可變形式對應(yīng)。與樣品DNA完全匹配的探針能夠在連接酶的催化下與熒光探針連接而不被洗脫，從而檢測到熒光信號。常用的酶還有熱穩(wěn)定性DNA連接酶，因?yàn)樗芨咛禺愋缘貦z測DNA堿基改變，并在較大的溫度范圍內(nèi)都有活性［14］。Yoshino等［15］構(gòu)建的單細(xì)菌磁粒子（BMPS）微陣列系統(tǒng)利用了限制性酶切的原理檢測了人的12號染色體上的ALDH2基因的寡核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。其步驟是直接將末端標(biāo)記的PCR產(chǎn)物固定在BMPS上，限制性酶切后檢測熒光強(qiáng)度值。如果被檢測基因是一種可以被酶切的基因型，那么熒光標(biāo)記末端被切下洗脫，檢測不到熒光或者熒光較弱，反之則較強(qiáng)。該法原理和操作簡單，酶切特異性強(qiáng)，但是由于酶切可能不完全，所以假陽性率較高。DNA結(jié)合反應(yīng)原理的SNP芯片該方法的原理是在開放模式的DNA芯片上進(jìn)行非特異性核酸雜交,再用熒光標(biāo)記的錯(cuò)配結(jié)合蛋白
法律信息相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1