用基因芯片檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理(已修改)
2025-07-19 16:12 本頁(yè)面
【正文】 用基因芯片檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理*中國(guó)生物工程雜志China Biotechnology, 2005, 25(11):52～56張小燕1**左明雪1張占軍2王忠3李瑤4(1 北京師范大學(xué)生命科學(xué)院北京1008752 北京中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院北京100086)(3 中國(guó)中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院北京1000914 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院上海200032）摘要基因芯片技術(shù)因其高通量、高效率的特點(diǎn)被用于第三代遺傳標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選。近幾年SNP芯片研究在反應(yīng)原理方面取得了重大進(jìn)展，其中包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片。比較了上述各種芯片技術(shù)方法的優(yōu)劣，為進(jìn)一步科研工作的開展提供了參照，并綜述了SNP芯片在疾病基因組學(xué)、藥物遺傳學(xué)和個(gè)體識(shí)別等科研領(lǐng)域的應(yīng)用，且對(duì)其今后的發(fā)展方向進(jìn)行了闡述。關(guān)鍵詞基因芯片單核苷酸多態(tài)性疾病基因組學(xué)收稿日期：20050125修回日期：20050901*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（90209015）** 電子信箱：dodderdodder@,涌現(xiàn)出大量可利用且亟待分析篩選的基因組數(shù)據(jù),這就要求有大規(guī)模、迅速的檢測(cè)方法與技術(shù)來(lái)完成大量候選基因中的遺傳標(biāo)記的篩選。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）與基因芯片（microarray）相結(jié)合的戰(zhàn)略正是應(yīng)這一需求脫穎而出,成為生命科學(xué)界關(guān)注的新焦點(diǎn)。1SNP芯片技術(shù)簡(jiǎn)介單核苷酸多態(tài)性是由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性,包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單個(gè)堿基的缺失和插入。其中最少的一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。作為第三代遺傳標(biāo)記的SNP在人類基因組中約每1 000個(gè)堿基就出現(xiàn)一個(gè)，并具有如下特點(diǎn)：(1)數(shù)量多,分布廣泛；(2)遺傳穩(wěn)定；(3)易于基因分型；(4)適于快速、高通量檢出。SNP自身的特性決定了它比其他兩類遺傳標(biāo)記更適合于對(duì)復(fù)雜性狀的遺傳解析以及基于群體基因識(shí)別等方面的研究,促使人們不斷地尋找新的SNP標(biāo)記和革新SNP檢測(cè)技術(shù)。目前已有多種方法可用于SNP檢測(cè),傳統(tǒng)的SNP檢測(cè)方法是采用一些已有的成熟技術(shù),如DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformational polymorphism ,SSCP)、變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等。這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對(duì)SNP的檢測(cè),但距快速、高效、自動(dòng)化的目標(biāo)還相差甚遠(yuǎn)。DNA芯片技術(shù)是近年來(lái)新開發(fā)的一種DNA序列變異檢測(cè)工具。其原理是利用目標(biāo)DNA與支持物上所固定的密集的寡核苷酸探針陣列進(jìn)行等位基因特異性反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)后信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)弱確定SNP位點(diǎn)。近年來(lái)隨著復(fù)雜性疾病研究的深入，以及可利用的基因組數(shù)據(jù)的增加, 基于各種原理的SNP芯片被開發(fā)出來(lái)，以適應(yīng)不同目的、規(guī)模和條件的基因分型。等位基因特異性寡核苷酸雜交反應(yīng)(allelespecific oligonucleotide hybridization, ASO)是利用固定在芯片上的寡核苷酸與標(biāo)記DNA靶標(biāo)的序列特異性雜交，其分辨原理基于單堿基錯(cuò)配對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，因此分辨率依賴于反應(yīng)中SNP位點(diǎn)前后的寡核苷酸序列和雜交反應(yīng)條件。該反應(yīng)很早已經(jīng)被廣泛使用，其優(yōu)點(diǎn)是原理簡(jiǎn)單、操作方便，缺點(diǎn)是由于非特異性雜交導(dǎo)致分辨率不高，易產(chǎn)生假陽(yáng)性［1］。2005, 25(11)張小燕 等：用基因芯片檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性反應(yīng)原理中國(guó)生物工程雜志 China Biotechnology 2005單堿基延伸反應(yīng)(single base extension，SBE)，又名微測(cè)序法(minisequencing),其原理如圖1所示，根據(jù)待檢測(cè)樣品的SNP位點(diǎn)5′端序列設(shè)計(jì)引物（不包括SNP位點(diǎn)）并將其直接固定在芯片上，以待測(cè)樣品的PCR產(chǎn)物作為模板，加以用各色熒光或者其他標(biāo)記物標(biāo)記的4種ddNTP，在適當(dāng)?shù)臈l件下，在DNA多聚酶的催化下與PCR產(chǎn)物配對(duì)的引物直接在芯片上進(jìn)行固相單堿基延伸反應(yīng)，根據(jù)樣本序列中特異的堿基（SNP）加入特異的ddNTP，檢測(cè)熒光的種類便知SNP信息［2］。DNA多聚酶的特異性使該方法的敏感度和分辨率均較高，但其缺點(diǎn)是必須使用多色熒光系統(tǒng)以及相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，而且多種染料的激發(fā)光和發(fā)射熒光的光譜往往會(huì)有較大部分的重疊，從而干擾對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)量精度［3］。圖1單堿基延伸反應(yīng)（SBE）檢
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