【正文】 EST序列拼接與SNP位點(diǎn)發(fā)掘采用Swat/Cross_match/Phrap軟。程序使用參數(shù)：p blastn m 9 e 1E10。 與CDS同源的EST序列聚類將2018530條玉米EST序列文件（FASTA格式）作為比對(duì)的庫(kù)文件，并BLAST軟件中的formatdb程序?qū)?kù)文件進(jìn)行格式化，程序使用參數(shù)：p F。使用ePCR程序，在命令行鍵入： w 9 f 1 m 100 d=100400 n=1 g=1 t=3運(yùn)行的結(jié)果包括： PCR產(chǎn)物在基因組上的位置、方向及擴(kuò)出條帶的數(shù)量?！primer3程序標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)Table 　Standard parameters of eprimer3 參數(shù)Parameter含義Meaning默認(rèn)值Defaultsequence輸入序列（從5′～3′ 端）必須輸入productsizerange產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍100300bpproductosize 產(chǎn)物長(zhǎng)度200bpnumreturn引物對(duì)數(shù)5minsize引物堿基的最小值 18bpmaxsize引物堿基的最大值27bpoutfile引物輸出文件名sequence.eprimer3 單一引物篩選程序的獲得及使用本研究是用ePCR程序從ePrimer3設(shè)計(jì)的引物中篩選能在玉米模式自交系“B73”基因組BAC文庫(kù)中擴(kuò)增出單一條帶的引物[[] Rotmistrovsky K, Jang W, Schuler GD. A web server for performing electronic PCR. Nucleic Acids Res, 2004, 32: W108112]。使用cross_match和phrap程序，在命令行鍵入： sequence productsizerange 1001500 outfile 運(yùn)行結(jié)果包括：引物的序列、Tm值、引物在模板上的結(jié)合位點(diǎn)、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度，默認(rèn)5對(duì)候選引物，一般使用第一對(duì)（最優(yōu)）引物。 引物設(shè)計(jì)程序的安裝及使用從EMBOSS的官方網(wǎng)點(diǎn)()上下載與windows操作系統(tǒng)兼容的embosswin ，并安裝?！ross_match/phrap程序功能及參數(shù)Table 　Function and parameters of cross_match/phrap program程序Program功能Function參數(shù)Parameter默認(rèn)值Defaultcross_match去除載體序列minmatch 14minscore 30screen載體標(biāo)示phrap對(duì)序列進(jìn)行拼接minmatch 14maxmatch30minscore 30（2）cross_match和phrap的使用，使用cross_match和phrap程序（文件中的序列必須為FASTA格式）。該程序軟件包運(yùn)行環(huán)境為RedHat Linux 10操作系統(tǒng)，所有的軟件在安裝時(shí)首先需要從壓縮包中釋放(命令為：gzip d*，tar xfv*)出來(lái)，然后進(jìn)入相應(yīng)子目錄進(jìn)行編譯后即可使用?！lastall的5種數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序及功能Table 　Five programs in blastall and their function程序Program檢索序列Query sequence數(shù)據(jù)庫(kù)Database功能Functionblastn核苷酸核苷酸尋找高分值的匹配，適合于較關(guān)系blastx蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)尋找較遠(yuǎn)關(guān)系的序列blastp核苷酸蛋白質(zhì)用于新的DNA和EST序列分析tblastn蛋白質(zhì)核苷酸（翻譯）尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有表注的編碼區(qū)tblastx核苷酸（翻譯）核苷酸（翻譯）用于分析EST序列　blastall程序的界面圖　The interface of blast system SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)系統(tǒng)的構(gòu)建該系統(tǒng)是以新編寫(xiě)的perl程序作為控制程序，使 cross_match、pharp、eprimer3和ePCR四個(gè)程序自動(dòng)執(zhí)行。在命令行中輸入“blastall”，則會(huì)輸出blastall程序的開(kāi)發(fā)界面（）。blastall程序包含一系列參數(shù)。對(duì)其進(jìn)行格式化, 在命令行鍵入：formatdb i p F 　Formatdb程序的主要參數(shù)Table 　Some important parameters of formatdb參數(shù)Parameter含義Meaningi輸入文件（FASTA格式的序列文件）p[T/F]T：創(chuàng)建蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)F：創(chuàng)建核酸數(shù)據(jù)庫(kù)o[T/F]T：創(chuàng)建該序列的ID和索引F：不創(chuàng)建n創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫(kù)的名字（如不使用該參數(shù)，則默認(rèn)為輸入文件名）v限制一卷的字符數(shù)（當(dāng)文件所含的字符數(shù)大4G時(shí)，設(shè)定需將序列文件按給定大小分為多個(gè)卷，每卷不超過(guò)2G。該軟件解壓后，會(huì)產(chǎn)生多個(gè)文件和文件夾，可得到BLAST的各種可執(zhí)行文件?！∶钚邪惭b界面　The interface of CommandLine installation 本地化序列比對(duì)系統(tǒng)的構(gòu)建 BLAST的本地化本地化BLAST軟件可直接從NCBI（）上下載。它可以自動(dòng)下載所有模塊目錄，搜索Bioperl模塊，并安裝?？赏ㄟ^(guò)，該網(wǎng)站內(nèi)有大量的模塊和使用方法，可根據(jù)實(shí)際情況安裝需要的模塊。檢測(cè)Perl是否安裝成功，在windows操作系統(tǒng)下，命令行鍵入：perl v not PERL or Perl如果Perl輸出它的版本號(hào)（），那么就表示平臺(tái)已安裝好。 實(shí)用數(shù)據(jù)提取系統(tǒng)的構(gòu)建 Perl語(yǔ)言平臺(tái)的安裝從ActiveState公司獲得windows系統(tǒng)下使用該軟件的許可證，然后在ActiveState官方網(wǎng)站上下載（）。2 材料和方法 本地化數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的構(gòu)建本研究的本地化數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)是根據(jù)對(duì)玉米EST序列分析的具體要求和已有軟件的功能，利用新開(kāi)發(fā)的一系列Perl腳本程序結(jié)合Blast、Phrap、EMBOSS、ePrimerePCR等程序所構(gòu)建的，包括實(shí)用數(shù)據(jù)提取系統(tǒng)、本地化序列比對(duì)系統(tǒng)和SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)系統(tǒng)。EST序列來(lái)自于不同機(jī)構(gòu)的不同文庫(kù)，這些序列間具有很高的多態(tài)性，且同一基因下的EST序列的條數(shù)反應(yīng)了該基因的表達(dá)豐度，所有這些冗余的EST序列是開(kāi)發(fā)這類SNP標(biāo)記的重要資源。更為重要的是，現(xiàn)有的SNP標(biāo)記大多是基于某個(gè)或者某類基因，以及某兩個(gè)或某幾個(gè)群體的表達(dá)序列標(biāo)簽或序列標(biāo)記位點(diǎn)單堿基差異所開(kāi)發(fā)的[[] Barbazuk WB, Emrich SJ, Chen HD, et al. SNP discovery via 454 transcriptome sequencing. Plant J, 2007, 51: 910918]，這樣的標(biāo)記在多種不同基因型間的遺傳多態(tài)性不高，通用性不強(qiáng)，所以提高SNP標(biāo)記的數(shù)量和質(zhì)量是非常必要的?！【换療晒庵等劢馇€　Normalized fluorescence resolution melt curves 現(xiàn)有的植物SNP數(shù)據(jù)庫(kù)目前已有的植物SNP數(shù)據(jù)庫(kù)也有很多，較為常用的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)主要有NCBI的基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)dbSNP（），該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了玉米、水稻、擬南芥、甘蔗等29個(gè)物種的SNP數(shù)據(jù)；植物分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)Plant Markers（），該數(shù)據(jù)庫(kù)包含多個(gè)物種的基于EST的SNP數(shù)據(jù)，除了SNP外還包括SSR數(shù)據(jù)；玉米、小麥、水稻SNP數(shù)據(jù)庫(kù)（），這也是基于EST數(shù)據(jù)產(chǎn)生的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)；水稻DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)（）和孟山都擬南芥多態(tài)性序列數(shù)據(jù)庫(kù)（），都是基于全基因組序列比對(duì)產(chǎn)生的；Gramene（）和Panzea（）是玉米分子標(biāo)記信息最為齊全的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。但HRM對(duì)每步升溫幅度的控制要求十分高，～℃，才能對(duì)單堿基的差異進(jìn)行區(qū)分；同時(shí)，樣品間溫度的均一性以及光源強(qiáng)度也是其制約因素。應(yīng)用高分辨率熔解曲線小擴(kuò)增子法進(jìn)行基因分型，能分析人類約 84% 的SNP位點(diǎn)[[] Liew M, Pryor R, Palais R, et al. Genotyping of singlenucleotide polymorphisms by high resolution melting of small amplicons. Clin Chem, 2004, 50(7): 11561164]，分析剩下16%的SNP，有時(shí)需在待測(cè)樣本中加入一種已知基因型的樣本，兩者混合后完成HRM 分析。 高分辨率溶解高分辨率溶解（High Resolution Melt，HRM）技術(shù)是在一定的溫度范圍內(nèi)將實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，期間實(shí)時(shí)檢測(cè)體系內(nèi)熒光信號(hào)，可應(yīng)用于基因分型、突變掃描、序列匹配檢測(cè)[[] Krypuy M, Newnham GM, Thomas DM, et al. High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in nonsmall cell lung cancer. BMC Cancer, 2006, 6: 295,[] Margraf RL, Mao, R, Highsmith WE, et al. Mutation scanning of the RET protooncogene using highresolution melt ing analysis. Clin Chem, 2006, 52(1): 138141,[] Vaughn CP, ElenitobaJohnson KS. HighResolution Melting Analysis for Detection of Internal Tandem Duplications. J Mol Diagn, 2004, 6(3): 211216]。 基因芯片技術(shù) 基因芯片又稱DNA芯片，該技術(shù)的原理是將大量的DNA片段有序地固定排列在固相支持物表面從而形成探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，用電腦進(jìn)行分析以檢測(cè)SNP位點(diǎn)。如果探針與目的序列存在錯(cuò)配堿基，則會(huì)影響釋放熒光的強(qiáng)度，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)液中熒光的強(qiáng)度來(lái)確定是否存在SNP。 TaqMan技術(shù)該技術(shù)原理是用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)[[] Takatsu K, Yokomaku T, Kurata S, et al. A new approach to SNP genotyping with fluorescently labeled mononucleotides. Nucleic Acids Res, 2004, 32(7): 60 ]。但雜交的效率受目的核苷酸和ASO探針之間溫度的穩(wěn)定性、鹽濃度、溫度、洗脫壓的影響，并且探針需要量較大[[] Huber M, M252。DHPLC在尋找未知的SNP時(shí)有明顯的優(yōu)勢(shì)，靈敏度高，尤其適于大片段DNA的分析；但只能檢測(cè)出樣品有無(wú)突變，不能測(cè)出突變類型。 變性高效液相色譜法變性高效液相色譜法（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）所用儀器的核心部分是DNA分離柱，柱結(jié)合的化合物使其帶正電荷，而DNA分子帶負(fù)電，通過(guò)控制DHPLC的溫度，將系統(tǒng)維持在接近DNA片段Tm值下運(yùn)行，DNA分子將根據(jù)其與固定相親和力的強(qiáng)弱被先后洗脫下來(lái)。一個(gè)堿基的突變可以使DNA片段的在凝膠電泳中遷移速率不同，從而達(dá)到分離的效果來(lái)檢測(cè)SNP。但目前直接測(cè)序費(fèi)用較高，不適用于多樣本群體間的大規(guī)模SNP檢測(cè)?！NP的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的原理[[] 鄧艷，魏東霞，朱興全．單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005，32(5)：3236,[] 彭翠英，廖端芳，張佳等．單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2004，27(10)：703705,[] 歐陽(yáng)建華，柳小春，施啟順等．單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)， 2003，25(6)：920923]主要是利用堿基變化產(chǎn)生新的或消除已有的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、堿基變化造成的堿基互補(bǔ)性對(duì)引物延伸反應(yīng)的影響、堿基變化對(duì)核酸分子雜交的影響、堿基變異對(duì)核酸分子在電場(chǎng)中遷移速度的影響以及堿基變異對(duì)核酸分子量所造成的改變等來(lái)檢測(cè)SNP是否存在。Jalving等[[] Jalving R, Slot R, Oost BA. Chicken single nucleotide polymorphism identification and selection for genetic mapping. Poultry Science, 2004, 83: 19251931]利用Phred/Phrap/Consed軟件包從327000條雞EST中發(fā)掘出32268個(gè)候選SNPs位點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)高密度的SNP遺傳圖譜，并選取24個(gè)進(jìn)行RFLP檢測(cè)，證實(shí)了其中的21個(gè)位點(diǎn)，%。此外，根據(jù)實(shí)際情況可將上述軟件的核心程序相互結(jié)合，用于發(fā)掘SNP位點(diǎn)。AutoSNP是根據(jù)單體型得出的共分離和序列冗余度來(lái)發(fā)掘SNP位點(diǎn)的，只有同一單體型中，冗余度超過(guò)2，參與組裝的序列超過(guò)4條，共分離權(quán)重超過(guò)50%時(shí)，這類SNP才被認(rèn)為是真實(shí)的[[] 張成崗，賀福初．生物信息學(xué)方法與實(shí)踐．科學(xué)出版社，2004][55]。Yamamoto