【正文】 （2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒的抑制效果（3）本文說(shuō)明[(ptap)Pt(en)](PF 6)2 的合成是可行的，下一步工作在于對(duì)其進(jìn)行提純，進(jìn)行分析師譚，探討其余 G四鏈體的作用機(jī)制。 展望 端粒酶的活性與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系。也說(shuō)明 K+緩沖環(huán)境對(duì)結(jié)構(gòu)識(shí)別效果更好，這可能是由于K +緩沖條件下形成的的G四鏈體更有利于其與配合物的作用。有明顯的紅移現(xiàn)象也說(shuō)明了，配合物和 DNA AG3(T2AG3)3 是有發(fā)生結(jié)合的。共 32 頁(yè) 第 29 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線(xiàn)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊5 結(jié)論和展望 結(jié)論本文設(shè)計(jì)合成了一個(gè)鉑配合物，運(yùn)用兩種手段研究了釕配合物與端粒 DNAG四鏈體結(jié)構(gòu)的鍵合作用，得到了以下結(jié)論：（1）通過(guò)核磁、質(zhì)譜表征方法證明首次合成了鉑配合物即[(ptap)Pt(en)](PF 6)2，只是由于時(shí)間限制，沒(méi)有進(jìn)行再次提純。02468101250101502025030IntesityConcetration/uM圖 415 配合物 2 滴定 DNA 鉀離子緩沖溶液在 600nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物2 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。0 2 4 6 8 10501015020IntesityConcetration/uM圖 413 配合物 1 滴定 DNA 鉀離子緩沖溶液在 600nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。共 32 頁(yè) 第 26 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線(xiàn)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊5050606507075080202040608010120140160180IntesityWavelngth/nm DNA 10uL合1 2 30uL1 4合 50uL1 6 70uL合1 8 90uL1圖412 鈉離子緩沖液中，配合物2與Gquadruplex作用的熒光滴定曲線(xiàn)，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。共 32 頁(yè) 第 25 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線(xiàn)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊50506065070750800501015020250IntesityWavelngth/nm DNA 10uL合1 2 30uL1 4合 50uL1 6 70uL合1 8 90uL1圖 410 納離子緩沖液中，配合物 1 與 Gquadruplex 作用的熒光滴定曲線(xiàn)，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。也說(shuō)明 K+緩沖環(huán)境對(duì)著兩種結(jié)構(gòu)識(shí)別區(qū)分效果更好，這可能是由于K +緩沖條件下形成的的G四鏈體更有利于其與配合物的作用。說(shuō)明配合物與G四鏈體的鍵合能力很強(qiáng)。從圖4441412中可以看出，DNA 在鉀、鈉離子緩沖溶液中幾乎沒(méi)有發(fā)光。熒光增強(qiáng)幅度的大小，基本上可以反映出配合物與DNA 作用的強(qiáng)弱。目前，G四鏈體被認(rèn)為是潛在的癌癥治療靶標(biāo)。富G 的鏈能在K+ 、Na+等陽(yáng)離子誘導(dǎo)下形成由堆積的四分體組成通過(guò)氫鍵穩(wěn)定的Gquadruplex 結(jié)構(gòu)。 釕配合物對(duì)端粒 G四鏈體與 DNA 作用強(qiáng)度的研究人類(lèi)的端粒含有重復(fù)銜接的雙鏈DNA 序列(5 ′ TTAGGG): (5 ′CCCTAA) 。共 32 頁(yè) 第 23 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線(xiàn)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊0 2 4 6 coration/uM圖 47 DNA 滴定鉀離子緩沖溶液配合物 2 在 450nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。共 32 頁(yè) 第 22 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線(xiàn)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊IntesityConcetration/uM圖 45 DNA 滴定鉀離子緩沖溶液配合物 1 在 450nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。但是，對(duì)于插入劑結(jié)合到四鏈體里面的G四分體之間是相當(dāng)困難的，不僅僅是因?yàn)樗逆滙w是一個(gè)穩(wěn)定和剛性的結(jié)構(gòu)，同時(shí)因?yàn)槠茐乃逆滙w的完整性需要耗費(fèi)很高的能量。一般對(duì)于雙鏈DNA 來(lái)說(shuō)，當(dāng)配合物以插入方式進(jìn)入 DNA 的堿基對(duì)時(shí)，與堿基對(duì)發(fā)生Π 電子堆積效應(yīng)，其Π*空軌道與堿基的Π 電子軌道發(fā)生耦合，能級(jí)下降，從而導(dǎo)致Π Π*躍遷能減小，產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。以上信息表明配合物可以與AG 3(T2AG3)3 的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的ΠΠ*作用。四種配合物在260280 nm 附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，在 450 nm 附近出現(xiàn)較弱的的吸收峰，均可歸屬為配體中的ΠΠ*躍遷， 450 nm 附近的吸收峰對(duì)應(yīng)于金屬釕配位體電荷轉(zhuǎn)移（MLCT） 。30 40 5001absWavelngth/nm 合 5uL DNA 10 5uL A 20 DN 5uL A 30 5uL DNA 40 圖 43 鉀離子緩沖溶液配合物 2 與端粒 Gquadruplex 作用的紫外滴定曲線(xiàn),[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8μM)。30 40 5001absWavelngth/nm 合 5uL DNA 10 5uL A 20 DN 5uL A 圖41 鉀離子緩沖溶液配合物1 與端粒Gquadruplex作用的紫外滴定曲線(xiàn),[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。從圖中可以看出，對(duì)于K +緩沖條件下，以 MLCT 峰看，配合物與DNA 作用后的減色率比在Na +緩沖條件下的減色率大。配合物與兩種端粒DNA作用后的LC 峰和MLCT 峰表現(xiàn)出了明顯的減色效應(yīng)和一定程度的紅移現(xiàn)象，因?yàn)镈NA 在可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有吸收，推測(cè)配合物 2在 K+、Na+緩沖溶液環(huán)境中都能與G 四鏈體發(fā)生某種相互作用。在紫外光譜圖中(圖442 、43 、44)，300 nm 以下的吸收峰為配體間的 Π Π*躍遷峰（IL)， 而可見(jiàn)光區(qū)450 nm 附近的吸收峰為配合物 的MLCT 峰，可以歸屬為Ru(dΠ) dpqdf( Π*)的躍遷吸收。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生往往來(lái)源于小分子配合物發(fā)色團(tuán)與DNA 堿基電子云的強(qiáng)烈相互作用。價(jià)鍵理論認(rèn)為，每個(gè)分子都有一系列嚴(yán)格分立的能級(jí)，處于低能級(jí)的分子受到光的能量激發(fā)時(shí)，可吸收特征頻率的光子而躍遷到較高的能級(jí)，進(jìn)而產(chǎn)生吸收光譜。 配合物與 G四鏈體作用的熒光光譜滴定在樣品池中加入 1950uL 的緩沖溶液以及 50uLDNA 儲(chǔ)備液，測(cè)定溶液在 620nm（440nm激發(fā)）處發(fā)光強(qiáng)度，隨后樣品池中每次加入 10uL 濃度為 200uM 的配合物 2 溶液，用移液槍反復(fù)吸吐，混勻，5 分鐘后檢測(cè)熒光情況，如此反復(fù)，滴加 10 次。. 配合物與 G四鏈體相互作用的紫外 ——可見(jiàn)光譜滴定在紫外可見(jiàn)吸收光譜儀的雙光路系統(tǒng)中，先往參比池中加入 475uL 緩沖溶液做參比，基線(xiàn)穩(wěn)定后，往樣品池中加入濃度為 10uM 的配合物溶液 25uL，用微量進(jìn)樣器每次往參比池和樣品池中加入 5uL 的 DNA 儲(chǔ)備液，混勻 5min 后，使 DNA 在配合物溶液中的濃度比值不斷增加，直至飽和。濃度確定：用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260。） ，分別溶于緩沖液 1 及緩沖溶液 2 中，緩沖溶液 476uL，密封加熱到 90℃，并保持 5 分鐘。2）富 G 四螺旋 DNA共 32 頁(yè) 第 18 頁(yè)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線(xiàn)┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊取兩份一定質(zhì)量富 G 單鏈 DNA（核苷酸序列為 539。濃度確定：用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260。用乙醇、乙醚洗滌干燥，得到咖啡色固體 ，產(chǎn)率 81%。2)[(dpqdf)Pt(en)](PF6)2 的合成將乙二胺 240μL 加入混有 20mL 乙二醇和 (dpqdf)PtCl2 的圓底燒瓶中，加熱 100oC 回流3h，未全部溶解。過(guò)濾，用水洗滌，去掉未反應(yīng)的 K2PtCl4，然后用少量乙醇、乙醚洗滌并進(jìn)行干燥。1)(dpqdf)PtCl2 的合成將 ()加入一圓底燒瓶中，向其中加入 35mL 乙二醇加熱近沸，全部溶解后，緩緩加入用 5ml 高純水溶解的 ()的 K2PtCl4(梅紅色晶體)，130 oC 加熱回流6 小時(shí)，出現(xiàn)紅棕色沉淀。 鉑配合物的合成對(duì)于鉑配合物的合成，設(shè)計(jì)了如下一種，并對(duì)其進(jìn)行了合成。4）雙呋喃基 dpqdf 的合成NNNH2NH2OOOO NNNNOOChemicalForula::12H0N4MolecularWeight::℃2d5，6二氨基1，10 鄰菲羅啉（，） ，2，2’雙呋喃二酮（， ） ，溶于 20mLDMF 置于 100mL 三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流 2 天。繼續(xù)回流 1 小時(shí)后停止反應(yīng)，趁熱過(guò)濾，旋蒸濃縮濾液，再加入過(guò)量的石油醚后析出黃色固體，抽濾后用石油醚洗滌濾餅 真空干燥。繼續(xù)回流 30 分鐘后停止反應(yīng)，冷卻至室溫后，將反應(yīng)液倒入 300600mL 冰水中，靜置一夜后抽濾，濾餅分別用水、甲醇和氯仿洗滌后干燥，得產(chǎn)物 產(chǎn)率 35%。產(chǎn)率 87%。 配合物的合成及表征 配體的合成1）5硝基鄰菲羅啉的合成 NN NN150℃ ， refluxH2SO4N3 NO2MolecularWeight: MolecularWeight:稱(chēng)取鄰菲羅啉 5g 置于 100mL 圓底燒瓶，加入 30mL 濃硫酸，緩慢升溫至 150℃，再逐滴加入 15mL 濃硝酸，反應(yīng)物繼續(xù)回流 3 小時(shí)后停止反應(yīng)，冷卻至室溫，將反應(yīng)混合液傾入含 500g冰的燒杯中，用事先配制好的 NaOH 溶液（50g NaOH 溶于 200mL 左右蒸餾水）調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH 值至接近中性（pH~5） 。本文設(shè)計(jì)合成得出了鉑配合物[(ptap)Pt(en)](PF 6)2，通過(guò)核磁、質(zhì)譜表征方法證明為此種配合物。在表征過(guò)程中特別是質(zhì)譜方面上，有些系列的配合物均與應(yīng)得的分子量有偏差，說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)生了其他的副反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)步驟還有待探索。此外，還有 pH 滴定、熱力學(xué)方法和電化學(xué)方法等，不過(guò)這些方法在研究小分子化合物與DNA 鍵合機(jī)理方面不太常用。由于密度泛函方法考慮了電子相關(guān)，計(jì)算速度快，并且能有效地估算配合物的分子結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)及其與 DNA 相互作用的前線(xiàn)分子軌道，引起了理論化學(xué)家的注意。在確定小分子化合物與 DNA 作用模式方面，流體力學(xué)方法(如粘度 [53]，沉降速度及在凝膠中的泳動(dòng)速度等)有其獨(dú)特的應(yīng)用。瞬時(shí)共振拉曼光譜：可以探測(cè)微環(huán)境的變化對(duì)配合物激發(fā)態(tài)的性質(zhì)或行為的影響，從而可以用來(lái)研究配合物與 DNA 的作用機(jī)理。當(dāng)配合物與 DNA 以插入方式作用時(shí)，DNA 熔化溫度(Tm)變化最大。核酸由多鏈結(jié)構(gòu)(雙螺旋或四螺旋) 變?yōu)閱捂溄Y(jié)構(gòu)的中點(diǎn)溫度反應(yīng)了該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，該溫度的變化也反應(yīng)了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化。利用圓二色譜儀同時(shí)可以做熱變性的實(shí)驗(yàn)。這樣的一種現(xiàn)象便有了一定的選擇性變化，更容易區(qū)分 G四鏈體的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，反應(yīng)配合物和 DNA 的結(jié)合模式。G四鏈體或 Imotif 結(jié)構(gòu)在圓二色譜中有著特殊的峰結(jié)構(gòu)：平行型 G四鏈體在 265nm 附近有正的最大吸收峰，240nm 附近有負(fù)的最大吸收峰；反平行型的 G四鏈體在 295nm 附近有最大正吸收峰，260nm 有最大負(fù)吸收峰；混合式的 G四鏈體構(gòu)型則包括了 290nm 附近的正吸收以及特征的 265nm 附近的肩峰。并根據(jù)強(qiáng)度的變化來(lái)判斷與 DNA 作用的強(qiáng)弱。熒光物質(zhì)在激發(fā)光的激發(fā)下，由基態(tài)躍遷到較高的能級(jí)(激發(fā)態(tài) )后，首先通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換過(guò)程消耗一部分能量，回到第一電子激發(fā)