【正文】 化推測(cè)其作用模式。摩爾消光系數(shù)為105m3cm1，取 DNA50uL，再加入 4950 的緩沖液，稀釋倍數(shù)為 100 倍，DNA 濃度[DNA]=KA260/105（K 是稀釋倍數(shù)） ，單位是 mol?L1。共 32 頁 第 16 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊3)[(dpqdf)Pt(en)](PF6)2 的表征圖 31 [(dpqdf)Pt(en)](PF6)2 的 1H NMR 譜共 32 頁 第 17 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊圖 [(ptap)Pt(en)](PF6)2 的質(zhì)譜示意圖 不同輔助配體的多吡啶配合物與 G四鏈體 DNA 的相互作用的研究 緩沖溶液的配制緩沖溶液用高純水配制緩沖溶液 1：100mM KCl，10mM Tris，pH=7緩沖溶液 2：100mM NaCl， 10mM Tris，pH=7 配合物與 DNA 濃度的確定 配合物濃度的確定配合物 1：[Ru(bpy) 2(dpqdf)]2+配合物 2：[Ru(phen) 2(dpqdf)]2+稱取一定質(zhì)量配合物分別用高純水和緩沖液 4 溶解 DNA 的處理和濃度確定1）富 G 單鏈 DNA取一定質(zhì)量富 G 單鏈 DNA，溶于高純水，放入 4℃冰箱保持 24h，備用。因時(shí)間關(guān)系，沒有對(duì)其進(jìn)行再次的純化。2）5氨基6硝基鄰菲羅啉 NNNO2NH2OHClK(Et)NNNO2NH2MolecularWeight: MolecularWeight:240.將 4g（）5硝基6氨基鄰菲羅啉溶于 100mL 無水乙醇并加熱回流，待反應(yīng)物全溶之后加入 8g（）鹽酸羥胺，此時(shí)析出淺黃色懸浮固體，并在 45 分鐘之內(nèi)，往上述混合液中滴加 KOH 的乙醇溶液（9g KOH 溶于 100mL 無水乙醇） ，反應(yīng)混合物逐漸變?yōu)樽攸S色。共 32 頁 第 13 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊3 實(shí)驗(yàn)部分 引言本章介紹了鉑多吡啶配合物的合成步驟，及其配合物的表征。 其他光譜法線二色譜(LD) 和電二色譜 (ED)：線二色譜和電二色譜都是采用與固定光軸方向 (在流動(dòng)梯度體系中旋轉(zhuǎn)和外加電場(chǎng)，使 DNA 螺旋軸取向固定)平行或垂直的平面偏振光，測(cè)量結(jié)合 DNA 后的配合物對(duì)垂直和平行于 DNA 的線偏振光的不同吸收。加入配合物后，會(huì)使其吸收峰發(fā)生移動(dòng)并改變其強(qiáng)度，明顯影響 G四鏈體的 CD 光譜。因此，我們可利用紫外吸收光譜對(duì)上述各核酸分子結(jié)構(gòu)的形成進(jìn)行初步判斷。圖 21 小分子與 G四鏈體的作用模式(a)外部堆積模式(b)插入模式(c)非特異性結(jié)合 DNA 與配合物作用的研究方法 光譜學(xué)方法 紫外可見光譜或電子光譜由于比較靈敏、直觀、方便，它是研究金屬配合物與DNA作用最常用的方法之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小分子配體與G 四鏈體的作用模式主要有兩種:外部堆積模式和插入模式(如圖21 所示)。由此，以 Gquadruplex 為靶點(diǎn)來尋求能夠誘導(dǎo)、穩(wěn)定或識(shí)別四鏈體結(jié)構(gòu)的小分子是當(dāng)前研究開發(fā)抗腫瘤藥物重要途徑之一。但是在大部分腫瘤細(xì)胞(85％)中，端粒酶則表現(xiàn)出了很高的活性，而在癌周圍組織和正常組織中端粒酶幾乎是沒有活性的。同時(shí)，這種結(jié)構(gòu)也使端粒酶不可能持續(xù)與端粒3’末端單鏈發(fā)生作用，從而保證了端粒長(zhǎng)度的恒定。端粒的主體是雙螺旋結(jié)構(gòu)，富GT鏈與富CA 鏈配對(duì)，但3 ’末端突出為一段單鏈懸掛。 Gquadruplex特殊結(jié)構(gòu)使得它能夠成為特異性的DNA靶點(diǎn)。因此，研發(fā)與G四鏈體相互作用的小分子抗癌藥物受到了廣泛的關(guān)注。在雙螺旋DNA 的大溝中存在多余的氫鍵給體和受體，這些氫鍵給體和受體可以和專一的結(jié)合分子(如蛋白質(zhì)) 發(fā)生相互作用，形成專一的復(fù)合物，也可以與單鏈DNA分子結(jié)合形成三螺旋DNA。由Watson和Crick兩位科學(xué)家于1953年提出來的一種結(jié)構(gòu)模型。 DNA 結(jié)構(gòu)DNA 之所以能含有生物物種的所有遺傳信息，是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，每個(gè)人體細(xì)胞的DNA 約含有 100 億個(gè)堿基。除了胚胎組織、生殖細(xì)胞和少數(shù)造血肝細(xì)胞中具有端粒酶火星外，絕大多數(shù)體細(xì)胞中無端粒酶活性，但是，85%以上的腫瘤細(xì)胞端粒酶表達(dá)呈陽性。核酸是生物體的重要組成物質(zhì)，在蛋白質(zhì)的生物合成上占重要位置，與生物的生長(zhǎng)、發(fā)育等正常生命活動(dòng)以及癌變、突變等異常生命活動(dòng)中起決定性的作用。目前鉑類配合物的合成已歷經(jīng)三代。順鉑、卡鉑的開發(fā)成功和臨床應(yīng)用給癌癥的治療帶來了一場(chǎng)新的革命。但是順鉑水溶性差，且僅能注射給藥，緩解期短，并伴有嚴(yán)重的腎、胃腸道毒性、耳毒性及神經(jīng)毒性，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性。G四鏈體是富含鳥嘌呤堿基的 DNA 通過氫鍵相互作用形成的四鏈螺旋結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)可以有效的抑制端粒酶的活性，它可以阻礙端粒酶對(duì)端粒 DNA 引物的識(shí)別，使細(xì)胞正常凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的效果，近年來，以 G四鏈體為靶點(diǎn)的抗癌藥物研究引起了人們的廣泛注意。為此，人們開始展開對(duì)其它鉑系抗腫瘤藥物的研究，但結(jié)果并不理想。有數(shù)據(jù)表明，DNA鏈中許多相鄰的堿基間兩個(gè)氮原子距離為340 pm，而順鉑中兩個(gè)氯原子間的距離為330 pm，兩者恰好匹配，形成的鉑化 DNA壽命較長(zhǎng)且不易被細(xì)胞蛋白如高移動(dòng)組(HMG)蛋白識(shí)別并修復(fù)，因而將破壞腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，抑制細(xì)胞分裂，最終殺死腫瘤細(xì)胞。順鉑是第一代鉑類抗癌藥物（），該藥的使用局限性是它的耐藥性及劑量毒性人體器官尤其是對(duì)腎臟的損害較大。因此，核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的重要基礎(chǔ)之一。因此，以抑制端粒酶活性為目標(biāo)的腫瘤基因治療研究已成為一種新的藥物作用靶點(diǎn)，而且極有希望成為最安全、有效的治療腫瘤的理想途徑。DNA 分子的結(jié)構(gòu)，有以下三種：第一，DNA 的一級(jí)結(jié)構(gòu)。在不同濕度和鹽濃度下，DNA的雙螺旋有著不同的構(gòu)象。三螺旋DNA一般是由一條寡核苷酸鏈通過與雙鏈DNA形成Hoogsteen 鍵或反Hoogsteen 鍵，在其大溝處緊密纏繞而成。四鏈體結(jié)構(gòu)是由富含G DNA單鏈，在特定離子強(qiáng)度和pH值條件下，由單鏈之間或單鏈內(nèi)對(duì)應(yīng)的G殘基形成Hoogsteen 堿基配對(duì)，從而使四條或四段富G DNA單鏈旋聚成一段特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。N NNNRHNHHONNNNRHNHHONNNNRHNHHONNNNRH N HHO圖 17 Gquadruplex 結(jié)構(gòu)大量研究表明含不同 G 序列所形成的四螺旋結(jié)構(gòu)是不同的，即使是相同的序列也可以按不同的方式進(jìn)行組裝。由于缺乏模板的引導(dǎo)，染色體合成過程中傳統(tǒng)的DNA 聚合酶就無法完全合成這個(gè)末端懸掛，從而造成端粒縮短，這就是所謂的“末端復(fù)制問題” 。共 32 頁 第 8 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊ 圖 左圖為人染色體末端的端粒 DNA；右圖為人端粒結(jié)構(gòu)示意圖正常細(xì)胞的端粒隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行性縮短，在每一次的復(fù)制循環(huán)中端粒都要減少50100個(gè)堿基對(duì)，細(xì)胞在進(jìn)行大約50次分裂后就開始衰亡。在正常的體細(xì)胞中，端粒酶的活性得到抑制，所以細(xì)胞每分裂一次，端粒就會(huì)縮短一些，當(dāng)達(dá)到一個(gè)臨界長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞染色體就會(huì)失去穩(wěn)定性，然后細(xì)胞將發(fā)生衰亡和凋亡。綜合以上所述，G四鏈體與端粒、端粒酶和腫瘤的關(guān)系可以歸結(jié)為下面這個(gè)流程圖。1) 外部堆積模式。一般來說，DNA 加入金屬配合物后，會(huì)對(duì)配合物的光、氧化還原等化學(xué)物理性質(zhì)產(chǎn)生影響，通過研究DNA加入前后配合物性質(zhì)的變化可對(duì)配合物與DNA的相互作用進(jìn)行初步研究。當(dāng)配合物插入到DNA 堿基對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)的吸收峰產(chǎn)生明顯的減色效應(yīng)，并伴有一定程度的紅移。這樣的一種現(xiàn)象便有了一定的選擇性變化，更容易區(qū)分 G四鏈體的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，反應(yīng)配合物和 DNA 的結(jié)合模式。瞬時(shí)共振拉曼光譜：可以探測(cè)微環(huán)境的變化對(duì)配合物激發(fā)態(tài)的性質(zhì)或行為的影響，從而可以用來研究配合物與 DNA 的作用機(jī)理。在表征過程中特別是質(zhì)譜方面上，有些系列的配合物均與應(yīng)得的分子量有偏差，說明反應(yīng)過程中可能發(fā)生了其他的副反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)步驟還有待探索。繼續(xù)回流 30 分鐘后停止反應(yīng)，冷卻至室溫后，將反應(yīng)液倒入 300600mL 冰水中，靜置一夜后抽濾，濾餅分別用水、甲醇和氯仿洗滌后干燥，得產(chǎn)物 產(chǎn)率 35%。1)(dpqdf)PtCl2 的合成將 ()加入一圓底燒瓶中，向其中加入 35mL 乙二醇加熱近沸，全部溶解后，緩緩加入用 5ml 高純水溶解的 ()的 K2PtCl4(梅紅色晶體)，130 oC 加熱回流6 小時(shí)，出現(xiàn)紅棕色沉淀。濃度確定：用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 在 260nm 的吸光度值 A260。. 配合物與 G四鏈體相互作用的紫外 ——可見光譜滴定在紫外可見吸收光譜儀的雙光路系統(tǒng)中，先往參比池中加入 475uL 緩沖溶液做參比，基線穩(wěn)定后，往樣品池中加入濃度為 10uM 的配合物溶液 25uL，用微量進(jìn)樣器每次往參比池和樣品池中加入 5uL 的 DNA 儲(chǔ)備液，混勻 5min 后，使 DNA 在配合物溶液中的濃度比值不斷增加，直至飽和。在紫外光譜圖中(圖442 、43 、44)，300 nm 以下的吸收峰為配體間的 Π Π*躍遷峰（IL)， 而可見光區(qū)450 nm 附近的吸收峰為配合物 的MLCT 峰，可以歸屬為Ru(dΠ) dpqdf( Π*)的躍遷吸收。30 40 5001absWavelngth/nm 合 5uL DNA 10 5uL A 20 DN 5uL A 30 5uL DNA 40 圖 43 鉀離子緩沖溶液配合物 2 與端粒 Gquadruplex 作用的紫外滴定曲線,[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8μM)。但是，對(duì)于插入劑結(jié)合到四鏈體里面的G四分體之間是相當(dāng)困難的，不僅僅是因?yàn)樗逆滙w是一個(gè)穩(wěn)定和剛性的結(jié)構(gòu)，同時(shí)因?yàn)槠茐乃逆滙w的完整性需要耗費(fèi)很高的能量。富G 的鏈能在K+ 、Na+等陽離子誘導(dǎo)下形成由堆積的四分體組成通過氫鍵穩(wěn)定的Gquadruplex 結(jié)構(gòu)。說明配合物與G四鏈體的鍵合能力很強(qiáng)。0 2 4 6 8 10501015020IntesityConcetration/uM圖 413 配合物 1 滴定 DNA 鉀離子緩沖溶液在 600nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物1 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。也說明 K+緩沖環(huán)境對(duì)結(jié)構(gòu)識(shí)別效果更好，這可能是由于K +緩沖條件下形成的的G四鏈體更有利于其與配合物的作用。 展望 端粒酶的活性與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系。02468101250101502025030IntesityConcetration/uM圖 415 配合物 2 滴定 DNA 鉀離子緩沖溶液在 600nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM，600nm左右的吸收峰變化是由于配合物2 濃度的增加 (從0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μM)。也說明 K+緩沖環(huán)境對(duì)著兩種結(jié)構(gòu)識(shí)別區(qū)分效果更好，這可能是由于K +緩沖條件下形成的的G四鏈體更有利于其與配合物的作用。目前，G四鏈體被認(rèn)為是潛在的癌癥治療靶標(biāo)。共 32 頁 第 22 頁┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊裝┊┊┊┊┊訂┊┊┊┊┊線┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊┊IntesityConcetration/uM圖 45 DNA 滴定鉀離子緩沖溶液配合物 1 在 450nm 左右的吸收峰滴定趨勢(shì)圖，[Ru]=10uM,450nm左右的吸收峰變化是由于DNA濃度的增加(從0,1,2,3,4,5μM)。四種配合物在260280 nm 附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，在 450 nm 附近出現(xiàn)較弱的的吸收峰，均可歸屬為配體中的ΠΠ*躍遷， 450 nm 附近的吸收峰對(duì)應(yīng)于金屬釕配位體電荷轉(zhuǎn)移（MLCT） 。配合物與兩種端粒DNA作用后的LC 峰和MLCT 峰表現(xiàn)出了明顯的減色效應(yīng)和一定程度的紅移現(xiàn)象，因?yàn)镈NA 在可見光區(qū)沒有吸收，推測(cè)配合物 2在 K+、Na+緩沖溶液環(huán)境中都能與G 四鏈體發(fā)生某種相互作用。 配合物與 G四鏈體作用的熒光光譜滴定在樣品池中加入 1950uL 的緩沖溶液以及 50uLDNA 儲(chǔ)備液，測(cè)定溶液在 620nm（440nm激發(fā)）處發(fā)