木瓜蛋白酶的提取(參考版)
2025-06-22 22:38本頁面
【正文】 每個(gè)樣本做三次平行。（3）、酶活終止液：50%（v/v）乙酸。而對(duì)硝基苯胺溶液為黃色,在410nm處有一個(gè)吸收峰,可以通過比色法測(cè)定對(duì)硝基苯胺的生成量,從而確定酶活大。實(shí)驗(yàn)四：再用實(shí)驗(yàn)二的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量 ，通過比較分析提純的效果，再通過SDSPAGE檢測(cè)提純后是否有目的蛋白，并大致估算蛋白的含量。原始質(zhì)量與所剩質(zhì)量之差即為凍干過程中的失水量。將冷凍后的培養(yǎng)皿去蓋,用保鮮膜包裹并在保鮮膜上均勻扎上小洞,放入真空冷凍干燥機(jī),凍干。（4）、木瓜蛋白酶的冷凍干燥時(shí)間測(cè)定：取25ml透析液分別放入8個(gè)干燥的無蓋培養(yǎng)皿中,在分析天平上準(zhǔn)確稱量各自的質(zhì)量,并記錄。木瓜蛋白酶在填料S SP 。 mg/ml。離子交換填料采用Sepharose SP Fast Flow 20 ml（柱子型號(hào)Amersham Biosciences XK 16,內(nèi)徑16mm）。同時(shí),將樣品進(jìn)行堿性蛋白非變性電泳和快速蛋白液相色譜（FPLC）檢測(cè),以驗(yàn)證雙水相體系對(duì)木瓜蛋白酶的提純效果.(3)、上相中木瓜蛋白酶與成相聚合物PEG的分離：經(jīng)雙水相體系分離后,木瓜蛋白酶被萃取到富含PEG的上相,因此要將木瓜蛋白酶同成相聚合物PEG分離。讀取上、下相體積。將配制好的雙水相體系放入4℃或20℃搖床中充分混合2h。其中,不同ph值的磷酸鹽溶液由40%（w/w）K2HPO4和40%（w/w）NaH2PO4配制而得。將該上清（大約45mg/ml）稀釋成不同的蛋白濃度,作為初始粗酶溶液待用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1)試劑：PEG 4000和6000，L半膚氨酸，二硫蘇糖醇DTT，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鉀，30%丙烯酞胺儲(chǔ)液，過硫酸銨，TEMED，Tris，透析袋（分子截留量3500），填料Sepharose SP Fast Flow，考馬斯亮藍(lán)G250和考馬斯亮藍(lán)R250，牛血清白蛋白，N苯甲酞DL精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽2）儀器：溫控?fù)u床，恒溫混勻儀，電熱恒溫水槽，紫外可見分光光度計(jì)，實(shí)驗(yàn)室Ph計(jì)，分析天平，電子天平，高速冷凍離心機(jī)，蛋白電泳系統(tǒng)，恒溫磁力攪拌器，真空冷凍干燥機(jī)，預(yù)裝柱HiTrap SPFF(1ML)，快速蛋白純化系統(tǒng)3）實(shí)驗(yàn)方法：（1）、粗酶溶液配制：稱取45g噴霧干燥的木瓜粗酶粉,在4℃下溶于半膚氨酸溶液（20Mm Cys，1Mm EDTA, PH ）中。物質(zhì)在雙水相體系中的分配系數(shù)不是一個(gè)確定的值,它要受許多因素的影響。雙水相萃取與水一有機(jī)相萃取的原理相似,都是基于被分離物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。上相富含明膠,下相富含瓊脂或淀粉,且兩相的主要成分都是水。雙水相萃取法提純實(shí)驗(yàn)原理： 兩種親水性高聚物或一種高聚物與鹽類在水中能形成兩層互不相溶的勻相水溶液,即雙水相體系。4） 羥基磷灰石柱色譜 上述透析產(chǎn)物室溫條件下上羥基磷灰石柱( cm20 cm)梯度洗脫,～ mol/L BPS(pH ), mL/min。3） SPsephadex C 50柱色譜 上述透析產(chǎn)物在室溫條件下上SPsephadex C50柱( cm20cm)進(jìn)行梯度洗脫,洗脫液是含0～ mol/L NaCl的醋酸緩沖液(50 mmol/L,pH ), mL/min。2） 硫酸銨分級(jí)沉淀 上述濾液中緩緩加入硫酸銨粉末至終濃度為20%,4℃老化30 min,8 000r/min離心5 min,棄沉淀。常作鹽析的無機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。實(shí)驗(yàn)三：木瓜蛋白酶的提純鹽析法：實(shí)驗(yàn)原理：鹽析法是指在藥物溶液中加入大量的無機(jī)鹽，使某些高分子物質(zhì)的溶解度降低沉淀析出，而與其他成分分離的方法。3）樣品蛋白含量測(cè)定：（1）、將待測(cè)樣品稀釋n和m倍,~；（2）、取稀釋過的樣品200ul加入試管中,加入2ml工作液,振蕩均勻,室溫放置5min,在595nm處測(cè)定吸光值；（3）、每個(gè)樣本做三個(gè)平行。2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：（1）、在若干潔凈試管中分別加入200ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)品0ul、10ul, 20ul, 30ul, 40ul, 50ul 和75ul,用雙蒸水補(bǔ)足至200ul；（2）、各管中加入2ml工作液,振蕩混勻,室溫放置5min,在595nm處測(cè)定吸光值；（3）、每個(gè)樣本做三個(gè)平行?；靹蚝笥肳hatman 1號(hào)濾紙過濾,棕色瓶保存,可使用數(shù)周,但在使用前需要再過濾。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1）試劑配置：（1）Bradford貯存液：稱取350mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于100ml 95%乙醇,加入200ml磷酸,置于暗處,室溫下可長期保存。實(shí)驗(yàn)二：蛋白濃度測(cè)定（Bradford法）
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