【正文】 391 / 14。感悟與寄語(yǔ)：參加“政基金”科研項(xiàng)目會(huì)讓我受益終生，深深感謝李政道先生的慷慨資助，深深感謝我的導(dǎo)師白書(shū)農(nóng)教授，深深感謝所有為“政基金”做過(guò)貢獻(xiàn)的老師和同學(xué)。我還要感謝我們實(shí)驗(yàn)室的全部師兄師姐師弟師妹，感謝他們對(duì)我的幫助和大家共同創(chuàng)造的積極向上的氛圍。致謝實(shí)驗(yàn)至此，我想對(duì)我的導(dǎo)師白書(shū)農(nóng)教授表達(dá)深深的謝意。主要從以下兩個(gè)方面著手：1. 完成根外植體植株再生整個(gè)過(guò)程中LFY基因的RNA水平整體原位雜交；2. 將Plfy::GFP轉(zhuǎn)入擬南芥，在熒光下跟蹤檢測(cè)Plfy的活動(dòng)，看Plfy活動(dòng)部位和出芽部位是否具有一致性。3. 用原位雜交的方法對(duì)LFY基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與以GUS為報(bào)告基因的啟動(dòng)子活動(dòng)具有一致性。本實(shí)驗(yàn)已獲得的證據(jù)有：1. LFY基因的啟動(dòng)子在植物發(fā)育早期即定位活動(dòng)于SAM，而不單與開(kāi)花相關(guān)。 圖3：質(zhì)粒Plfy::GFP的構(gòu)建: 檢測(cè)Plfy::antiLFY (Plfy)Lane 1: λDNA/EcoRI+HindIII DNA Marker Lane 2: Plfy::antiLFY plasmid Lane 3: Plfy::antiLFY/EcoRI+XbaI Lane 4: Plfy::antiLFY/EcoRI+XhoI Lane 5: Plfy::antiLFY/EcoRI+KpnI Lane 6: Plfy::antiLFY/PstI+XbaI Lane 7: Plfy::antiLFY/PstI+XhoI Lane 8: Plfy::antiLFY/PstI+KpnI Lane 9: DL2000 DNA Marker: 檢測(cè)Plfy::antiLFY（antiLFY）Lane 1: λDNA/EcoRI+HindIII DNA Marker Lane 2: Plfy::antiLFY質(zhì)粒 Lane 3: Plfy::antiLFY/XbaI+SacI Lane 4: Plfy::antiLFY/XhoI+SacI Lane 5: Plfy::antiLFY/KpnI+SacI Lane 6: Plfy::antiLFY/XbaI+BamHI Lane 7: Plfy::antiLFY/XhoI+BamHI Lane 8: Plfy::antiLFY/KpnI+BamHI Lane 9: DL2000 DNA Marker：檢測(cè)Pnfl::GFP（GFP）Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: Pnfl::GFP/XbaI+SacI Lane 3: Pnfl::GFP質(zhì)粒：檢測(cè)Pnfl::GFP（GFP）Lane 1: 以無(wú)菌水為模板的PCR產(chǎn)物（負(fù)對(duì)照） Lane 2: 正對(duì)照 Lane 3: 以Pnfl::GFP為模板的PCR產(chǎn)物 Lane 4: DL2000 DNA Marker: 新構(gòu)建的Plfy::GFP酶切鑒定（檢測(cè)Plfy）Lane 1: Plfy::antiLFY質(zhì)粒 Lane 2: 新構(gòu)建的Plfy::GFP質(zhì)粒 Lane 3: Plfy::antiLFY/PstI+XbaI Lane 4: Plfy::GFP/PstI+XbaI Lane 5: Plfy::GFP/PstI+BamHI Lane 6: Plfy::antiLFY/EcoRI+XbaI Lane 7: Plfy::GFP/EcoRI+XbaI Lane 8: Plfy::GFP/EcoRI+BamHI Lane 9: DL2000 DNA Marker: 新構(gòu)建的Plfy::GFP酶切鑒定（檢測(cè)GFP）Lane 1: Pnfl::GFP質(zhì)粒 Lane 2: Pnfl::GFP/XbaI+SacI Lane 3: Plfy::GFP/XbaI+SacI Lane 4: Plfy::GFP質(zhì)粒: 新構(gòu)建的Plfy::GFP PCR鑒定（檢測(cè)GFP）Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: Plfy::GFP PCR產(chǎn)物 Lane 3: Pnfl::GFP PCR 產(chǎn)物 Lane 4: 以水為模板的PCR結(jié)果 Lane 5: DL2000 DNA Marker 討論本實(shí)驗(yàn)的目的是深入研究LFY類基因的功能。同理，::GFP并排作酶切、跑電泳，證明了切出的小片段是來(lái)自于Pnfl::GFP的GFP。 連接后，對(duì)重組載體進(jìn)行篩選。而對(duì)于Pnfl::GFP，GFP既是新載體需要片段，又是要用酶切下的，而Pnfl并沒(méi)有什么作用，所以只用檢測(cè)GFP就夠了，這里用了酶切和PCR兩種方法，切出的GFP 750bp左右，PCR條帶500bp左右，和預(yù)期相符。 首先，我用酶切的方法和PCR的方法檢測(cè)了Plfy::antiLFY和Pnfl::GFP兩個(gè)質(zhì)粒的正確性。如果Plfy活動(dòng)部位和出芽部位確有一致性，則為我們的假設(shè)提供了一個(gè)有力的證據(jù)。但是莖端分生組織的這團(tuán)細(xì)胞是否來(lái)自莖端分生組織形成前有LFY活動(dòng)的細(xì)胞，目前還沒(méi)有直接的證據(jù)。4. Plfy::GFP載體的構(gòu)建 在Plfy::GUS擬南芥根外植體植株再生過(guò)程中，愈傷組織中可發(fā)現(xiàn)明顯的GUS活動(dòng)，至于有GUS活動(dòng)的部位是否會(huì)出芽，目前還不得而知，因?yàn)榻M織化學(xué)染色將殺死細(xì)胞，失去繼續(xù)培養(yǎng)、跟蹤觀察的可能。后續(xù)的檢測(cè)工作正在進(jìn)一步進(jìn)行。7天大小、14天大小的擬南芥幼苗以及花序中，LFY基因的表達(dá)定位于莖端分生組織和葉原基、花芽原基中，而在莖的其他部分、花梗、成熟的葉片中，檢測(cè)不到LFY的表達(dá)信號(hào)。 圖1：探針制備電泳圖譜: 質(zhì)粒酶切圖譜Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: LFY/BamHI+KpnI ，小片段即為切出的LFY基因 Lane 3: LFY/KpnI，已線性化完全 Lane 4: LFY/BamHI，已線性化完全 Lane 5: LFY質(zhì)粒對(duì)照1. 2: 轉(zhuǎn)錄后電泳圖譜（未經(jīng)Dnase處理）Lane 1: LFY/KpnI （T7轉(zhuǎn)錄酶） Lane 2: LFY/BamHI（T3轉(zhuǎn)錄酶） Lane 3: Control 箭頭所示為轉(zhuǎn)錄出的RNA條帶1. 3: 水解后電泳圖譜Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: LFY/KpnI Lane 3: LFY/BamHI Lane 4: Control 箭頭所示為水解后的RNA小片段 雜交結(jié)果見(jiàn)圖版3。我用BamHI和KpnI雙切pDW124LFY質(zhì)粒，切出LFY基因，檢測(cè)了該質(zhì)粒的正確性。詳細(xì)流程如實(shí)驗(yàn)方法中所述。如果LFY基因確實(shí)在RNA水平上存在與啟動(dòng)子相同的表達(dá)特點(diǎn)，則表明啟動(dòng)子分析結(jié)果是可靠和有意義的，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了我們關(guān)于LFY基因功能的假說(shuō)。3. RNA水平上的LFY表達(dá)特征與GUS檢測(cè)結(jié)果相同考慮到現(xiàn)有的文獻(xiàn)中所述現(xiàn)象，啟動(dòng)子的研究不能完全反映基因的真實(shí)表達(dá)情況（詳見(jiàn)引言部分），要想清楚地研究其功能，我們必須直接檢測(cè)該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明，LFY基因在植物幼苗SAM和葉原基、芽原基中的表達(dá)特點(diǎn)是具有普遍性的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我熟練掌握了植物組織培養(yǎng)、GUS組織化學(xué)染色解剖觀察和照相等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技能，為進(jìn)一步的工作打下了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果再次驗(yàn)證了在擬南芥中，Plf