基因診斷和基因治療(1)(參考版)
2025-05-31 01:39本頁面
【正文】 巢式 PCR 。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有 mRNA）的靈敏度，并且提高了困難 PCR（如 539。巢式 PCR 的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同兩套引物都互補的靶序列很少?；蛘撸部梢酝ㄟ^凝膠純化將起始擴增產物進行大小選擇。第一輪是 15 到 20 個循環(huán)的標準擴增。 組織專一性表達的調節(jié)片段 : 基因治療的應用及展望 應用治療： ? 遺傳?。▽W友病、囊性纖維病、家族性高血壓 ? 惡性腫瘤 ? 心血管疾病 ? 感染性疾?。?AIDS、類風濕等） 呈待解決的問題： ? 外源基因表達效率 ? 外源基因表達調控 ? 遺傳性疾病面臨的免疫問題 ? 反轉錄病毒載體隨機插入的外源基因，若插入不當，可能破壞另一個基因的表達或激活其它基因（潛在的危險）。 方法： （目的基因和標記基因的表達） 原位雜交、 Nouthern雜交、 RNA點雜交 （檢測 mRNA的轉錄） 免疫組化染色（檢測基因翻譯出的蛋白質 ) 外源基因表達的檢測： 回輸體內 將治療性基因修飾的細胞通過不同方式回輸 入體內，以發(fā)揮治療效果。 淋巴細胞：易采集、分離，大量繁殖，連續(xù) 多次輸入 癌細胞：腫瘤治療常用細胞。 肝細胞：是許多遺傳代謝缺陷的靶細胞。 只有部分干細胞有活性 造血干細胞分化可能導致基因失活。 常用細胞： 優(yōu)點 ：⑴ 易接受各種處理、⑵已積累豐富經驗，⑶多數遺傳疾病 涉及骨髓細胞、⑷源自骨髓的細胞遍布全身。 易于受外源遺傳物質的轉化。 骨髓細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、血管內皮細胞、肌細胞 選擇原則 : 較堅固，耐受處理，易于由人體分離，便于輸 回體內。 結構： rep基因－－編碼病毒的復制、整合功能所需蛋白 cap基因－－編碼病毒結構組分 ITRs序列－－反向末端重復，定義基因的開始和 結束，制約 DNA序列大小，包裹入 衣殼。 腺相關病毒 (AVV ) 一種小的、非致病的、單鏈 DNA病毒。 有致細胞癌變的可能。 逆轉錄病毒載體的缺陷： 只能轉染處于增殖狀態(tài)的細胞 所攜帶的外源基因不能太大。 （ 3）載體 DNA導入輔助細胞，產生病毒載體。 逆轉錄病毒 病毒 RNA 宿主細胞 RT RT 逆轉錄酶 cDNA 雙鏈 插入 基因組DNA 逆轉錄病毒感染過程 病毒 RNA 構建逆轉錄病毒載體： （ 1）構建 重組 野生性病毒：插入相關外源基因，改造成 DNA載體（包括插入選擇性標記），替代病毒的編碼基因。 將病毒 DNA轉運至宿主細胞核 病毒 DNA整合到宿主染色體 以病毒 DNA為模板轉錄 RNA 在細胞中翻譯 Gag、 Pol和 Env蛋白 形成衣殼， RNA單鏈和反轉錄酶一起包裝進衣殼。 優(yōu)點：多數病毒可感染特異細胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色體，表達 水平高等。 復制、分裂和整合能力：特異性定位整合，或以游離基因形式 存在于細胞核內。 組織靶向性 定向輸入某種細胞。 理想的載體具有以下特征： 容易生產 商業(yè)化生產，廣泛應用，易運輸，易保存 持續(xù)表達 一旦轉入體內，應能在一定時間內持續(xù)表達基因產 物，或能通過某種方法精細調節(jié)其表達。 選擇治療的目的基因 用于基因治療的基因應滿足以下條件： （ 1）體內僅少量表達就可顯著改善癥狀。（普遍采用） 直接將外源基因導入體內有關的組織器官 ,使其進入相應的細胞并轉錄、表達而發(fā)揮治療作用。 生殖細胞基因治療：生殖細胞或胚胎干細胞補償性治療 基因治療基本程序 。 基因治療的策略： 調節(jié)性基因治療： 導入編碼調控蛋白的基因，治療 基因表答異常的疾病 化療保護性基因治療： 導入單相或多相細胞毒性藥 物的抗性基因，使正常細胞耐受化療藥物的能力大 大提高。 基因失活－－利用反義技術特異封閉基因表達，抑制有害基因 的表達。 －－利用外源基因對病變細胞造成特異性殺傷 基因矯正－－將致病基因的堿基進行糾正，而正常部分予以保留。 概念的擴展： 凡是采用分子生物學方法原理，將某種遺傳物質轉移 到患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，達到治療目的 的方法，都可稱為基因治療。 第二節(jié) 基因治療（ gene therapuy) 概念： 將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因缺陷和異?；蛞鸬募膊?，達到治療目的。 針對可變串聯重復序列（ VNTR） （ VNTR是判斷個體的遺傳標志） ⑵ 、針對 VNTR側翼保守區(qū) 序列設計探針，用 PCR 對該區(qū)擴增，電泳得到個體之間長度不同的條 帶圖譜。 （ 1）酶類腫瘤標志物 （ 2）激素類標志物 （ 3）胚胎抗原 （ 4）特殊蛋白標志物 （ 5）糖蛋白類抗原 （ 6）血中癌基因蛋白 （ 7）唾液酸和唾液酸?；D移酶 （ 8）多胺 免疫組化篩選提高檢出率 法醫(yī)學鑒定 針對人類 DNA 遺傳差異進行的個體識別和親子鑒定。 抑癌基因的檢測： Southern
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