【正文】 骨髓Date 225Date 226Date 227? ㈤染色體組大片段的刪除和重排exon1 hprtΔ3 hprtΔ5 exon10Creexon9 hprtΔ5hygro exon10exon1 hprtΔ3 neo exon2 第一次打靶第二次打靶Date 228? ㈥基因敲入法研制轉(zhuǎn)基因小鼠CreCre酶誘導(dǎo)的重組Date 229。chain心 臟Aminopeptidaseenhancer肝 臟αmyosin③ 同源重組：可借助自然存在的靶基因啟動(dòng)子和 AUG使 neor高表達(dá)用 G418篩選抗性細(xì)胞， Southern blot和 PCR區(qū)分同源重組和隨機(jī)重組的細(xì)胞克隆， G418只需一次篩選。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 216Cre重組酶介導(dǎo)兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程，可以分成三種情況： 　　如果兩個(gè) LoxP位點(diǎn)位于一條 DNA鏈上，且方向相同， Cre重組酶能有效切除兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間的序列； 　　如果兩個(gè) LoxP位點(diǎn)位于一條 DNA鏈上，但方向相反， Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間的序列倒位； 　　如果兩個(gè) LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上， Cre酶能介導(dǎo)兩條 DNA鏈的交換或染色體易位。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 215應(yīng)用 CreLoxP系統(tǒng)將精細(xì)突變導(dǎo)入基因組的原理是：在置換型的打靶載體中，正負(fù)篩選標(biāo)記基因兩側(cè)各放置一個(gè) LoxP序列，并被置于靶基因的內(nèi)含子中；攜帶精細(xì)突變的外顯子位于載體一側(cè)的同源臂上。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Cre重組酶：于 1981年從 P1噬菌體 中發(fā)現(xiàn)，是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。 染色體內(nèi)重組 去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列，由于負(fù)篩選標(biāo)記基因的消失，細(xì)胞就恢復(fù)了對(duì)負(fù)篩選藥物的抗性，因此，回復(fù)突變體可以在負(fù)選擇培養(yǎng)基中存活下來(lái)。cellDate 210打了就走策略 (Hit and Run ) 也稱(chēng)進(jìn)退策略。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 209HPRT同源重組發(fā)生后，突變序列整合入基因組， Hprt 被置換出來(lái)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 207Date 208雙置換法 (Double Replacement) 第一步用含有 Hprt基因的重組載體轉(zhuǎn)染Hprt–ES細(xì)胞， Hprt基因的雙側(cè)是靶基因同源序列，通過(guò)培養(yǎng)基篩選發(fā)生同源重組、 Hprt 基因整合到基因組中的陽(yáng)性克隆。 該方法的特點(diǎn)是它是用兩個(gè)不同的置換型載體進(jìn)行兩次連續(xù)的基因重組完成。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 204精細(xì)突變的引入插入法和置換法共同的缺點(diǎn)是靶位點(diǎn)上最終留下了有轉(zhuǎn)錄活性的外源標(biāo)記基因 , 這對(duì)于研究基因組中更加精細(xì)、復(fù)雜的改變十分不利 。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 203利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的 ES 細(xì)胞庫(kù) , 節(jié)省大量篩選染色體組文庫(kù)以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用 , 更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 199基因誘捕載體的特點(diǎn) : ① 無(wú)啟動(dòng)子② 報(bào)道基因上游有一個(gè)剪接受體位點(diǎn)在內(nèi)源性基因的順式調(diào)控元件啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性作用下 ,通過(guò) mRNA 前體的剪接 , 上游編碼基因與報(bào)道基因產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄 , 內(nèi)源性基因表達(dá)受阻 , 報(bào)道基因以?xún)?nèi)源基因模式進(jìn)行表達(dá)。從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該 100％地含有中靶基因。 逆轉(zhuǎn)錄病毒 可用于 動(dòng)植物細(xì)胞 的插入； 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 TDNA轉(zhuǎn)化 和 轉(zhuǎn)座子 常用 植物細(xì)胞 ； 噬菌體 可用于 細(xì)菌 基因敲除。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 197此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 196大規(guī)模隨機(jī)基因剔除 — 基因捕獲(gene trapping)基因誘捕 (gene trap)是基于小鼠胚胎干細(xì)胞、報(bào)道載體 (誘捕載體 )建立的一種基因突變方法。篩選的 /、 +/子二代小鼠。5 、獲得子代小鼠，篩選帶有靶基因的小鼠。 體外篩選打靶成功的細(xì)胞。－胚胎工程Date 190簡(jiǎn)要過(guò)程129系Date 191將載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞 選取發(fā)育第 45天的胚胎干細(xì)胞 (ES) 。③ 同源重組：可借助自然存在的靶基因啟動(dòng)子和 AUG使 neor高表達(dá)用 G418篩選抗性細(xì)胞， Southern blot和PCR區(qū)分同源重組和隨機(jī)重組的細(xì)胞克隆， G418只需一次篩選。只有 hprt＋ 細(xì)胞能在 HAT培養(yǎng)基中生存，此為正向選擇只有 hprt－ 細(xì)胞能在 6TG培養(yǎng)基中生存，此為負(fù)向選擇第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 187? ⑶ 正向選擇法promoter ATG neor同源序列 1 同源序列 2同源序列 1 neor 同源序列 2同源序列 1 neor 同源序列 2以往的基因打靶載體正向選擇的打靶載體隨機(jī)插入： neo無(wú)啟動(dòng)子和起始密碼子，在 G418中死亡同源序列 1 同源序列 2promoter ATG target內(nèi)源性 hprt基因可作為正向和負(fù)向選擇的標(biāo)記基因。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 182neo/tk：無(wú)外源基因整合，細(xì)胞在G418中死亡；neo＋ /tk＋ ：隨機(jī)整合，在 GCV中死亡；neo＋ / tk：同源重組，在 G418和GCV中存活。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 181HSVTK基因插入外源基因外側(cè)的載體序列中。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 179⑴ 新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法① neor ：新霉素抗性基因，陽(yáng)性篩選標(biāo)志， neor基因插入用于打靶的外源 DNA中，當(dāng)重組后，細(xì)胞能在含新霉素（ G418)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型2）打靶載體的篩選標(biāo)志⑴ 新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法⑵ hprt正負(fù)雙向選擇法⑶ 正向選擇法Date 178為了更好地篩選發(fā)生同源重組的克隆， 1988年 Mansour等人設(shè)計(jì)了正負(fù)雙向選擇系統(tǒng) (positivenegativeselection, PNS), 解決了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合的鑒別問(wèn)題。library（ 129Vector正負(fù)選擇載體Neo抗性基因 HSVtk基因Date 175通用型打靶載體Mouse第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 173如何獲得剔除小鼠 ?剔除目的基因Date 174PositiveNegative篩選 knockout動(dòng)物和表形分析Date 172同源重組分解特定基因的定向基因要考慮特定基因產(chǎn)物的精確分析基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的 DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因 (如 neo 基因， TK 基因等 )的載體上，成為重組載體。篩選中靶細(xì)胞? 第三步 Date 171第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型“四步走 ”? 第一步 第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 167Date 168Date 169Date 170? 二者主要區(qū)別在于線性化位點(diǎn)不同。 而在隨機(jī)插入時(shí) , 負(fù)選擇基因也將被插入基因組中 , 帶有 tk基因的細(xì)胞會(huì)被培養(yǎng)基中的毒性核苷酸類(lèi)似物的代謝產(chǎn)物殺死 , 這樣就可以篩選出定點(diǎn)整合的細(xì)胞。插入型載體與靶基因在同源區(qū)發(fā)生一次單交換后 , 將造成整個(gè)載體插入染色體同源區(qū) , 從而使同源序列增加一個(gè)拷貝。Date 159基因敲入（ gene knock in）是利用基因同源重組，將外源有功能基因（基因組原先不存在、或已失活的基因），轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。thatthatdesignpossibleitparticularflankingDNAofknowDate 156Date 157If第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 153同源重組的分子過(guò)程兩段較長(zhǎng)的同源 DNA或同源染色體彼此靠攏，在二條相同極性上斷裂產(chǎn)生交叉結(jié)構(gòu)在交叉處橫斷內(nèi)切，產(chǎn)生 4種含有異源雙鏈的重組產(chǎn)物同源重組發(fā)生于兩個(gè)較長(zhǎng)的同源DNA或同源染色體之間，且需要重組蛋白 A （ RecA）參與第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 154Date 155外源基因 宿主基因組 同源重組后的基因組 同源重組模式HollidayDate 150三種技術(shù)的融合firstsecond thirdDate 151基因剔除基因剔除 (Gene Knockout)基因敲除 是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知或未完全知道的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因從動(dòng)物的原基因組中去除，或用 其它無(wú)功能的DNA片斷取代 ，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表型，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Date 141Date 142G0代編號(hào) 檢測(cè)（ 3周齡）PCRSouthernDate 143G0代 整合檢測(cè)：棄去 +：保留 X 野生型G1代：棄去+：半合子 X 半合子：棄去+：純合子G2代表型檢測(cè)founder鼠互交Date 144Date 145heterozygoteDate 146Date 147Date 148第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨著一些問(wèn)題生產(chǎn)效率低基因整合效率不高生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物死亡率高常出現(xiàn)不育導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因難以傳代無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)Date 149第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型概念：基因打靶是利用 DNA同源重組原理，在基因組中的某一特定部位進(jìn)行定點(diǎn)的基因重組，是研究基因的功能的有效手段。經(jīng)擴(kuò)大繁殖，從中選擇外源目的基因表達(dá)效果好、適應(yīng)性好的轉(zhuǎn)