【正文】 7)移植 (Transplantation)。 5) 生長和再生的治療過程 (Growth and regeneration processes for therapy)。 3) 生物制藥 。 ESCs） 人工受精 2. 進一步的發(fā)展前景 : 1)功能基因組學 (Functional genemics)。 7)克隆 (Cloning) 。 5)人先天缺失 (Human birth defects)。 在轉(zhuǎn)基因結構中通常還會攜帶一個供篩選轉(zhuǎn)基因動物的基因 . 六 . 發(fā)育生物學的現(xiàn)代應用 1. 發(fā)育生物學的當代最新應用發(fā)展 decades. 1)體外受精 (In vitro fertilization ； IVF) 2)人工授精 (Artificial Insemination by Donor ； AID) 3)器官發(fā)生 (Organogenesis)。 ? 在轉(zhuǎn)基因過程中 ， 轉(zhuǎn)座酶基因由另外一個獨立的質(zhì)粒提供 。 在果蠅中 ， 外源基因通常插入轉(zhuǎn)座子 p因子中注射入胚胎生殖質(zhì)中 ， 在其后代中可以獲得轉(zhuǎn)基因動物 。 最后 將反應混合物注射入未受精的卵子中 。 通過子二代自交就可以獲得純合的個體 。 另一種是 通過胚胎干細胞介導 ， 即 先將外源基因轉(zhuǎn)化到胚胎干細胞中 ， 通過抗藥性的篩選獲得外源基因穩(wěn)定插入的細胞 ，再將這些細胞注射到囊胚中 ， 使之摻入胚胎組織中 ， 獲得嵌合體 。 其優(yōu)點是不需要替換內(nèi)源基因，實驗周期短，但并不是所有分子都具有顯性抑制型結構。 顯性抑制型蛋白是 通過某種修飾或加工，可以抑制野生型蛋白功能的缺陷型蛋白 。非翻譯區(qū) ， 或者起始密碼子下游的前 25個堿基 。 MO具有許多優(yōu)勢：一是它 不會被內(nèi)源的核酸酶所降解 ， 穩(wěn)定性高； 二是由于骨架不帶電 ， MO與核酸結合蛋白發(fā)生非特異結合的可能性很小 ， 作用效率高 。 傳統(tǒng)的反義寡聚核苷酸不穩(wěn)定 、 專一性差和效率低 。 另一方法是通過形成短發(fā)夾結構 RNA(sbort hairpin RNA,shRNA) , shRNA可被 Dicer加工成為 siRNA。 人們采用了多種方法來避免這一問題 。 但在脊椎動物中 ， RNAi的作用效果還不理想 ， 特別是作用的特異性似乎不夠高 ， 阻礙了這一技術的應用 。 ② 將線蟲浸泡在含 dsRNA的溶液中 。 siRNA進而結合到一種蛋白復合體中 ， 形成 RNA誘導的沉默復合體 (RNA induced silencing plex， RISC)。 近年來 ，RNA干擾的研究已成為熱點 ， 并被 Science評選為 2022年度最重要科技突破的首位 。 他們將這種現(xiàn)象稱為 RNA干擾 (RNA interference， RNAi)。 C. RNA干擾技術 抑制某一特定基因的表達 ,是研究基因功能的重要方法 . RNA干擾是近年來發(fā)展的一種特異性抑制基因表達的新方法 。 在這種情況下 ， 可將一段兩邊分別帶有 loxP位點并含有終止子的序列插入到目的基因內(nèi)部并構建轉(zhuǎn)基因小鼠 。 進行條件基因敲除 需構建兩個小鼠品系 ， 在其中 一個品系中在靶基因兩側都插入 loxP位點 ， 在另一個品系中需要轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動子控制的 cre基因 。 條件基因敲除小鼠 是指僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時期失活 . 常采用 Crelox系統(tǒng) 。 通過抗藥性篩選可以獲得攜帶有重組基因的胚胎干細胞品系 。 在基因突變片段兩側應帶有足夠長的與內(nèi)源基因相同位置同源的序列以利于同源重組的發(fā)生 。 進行基因敲除 第一步是構建用于基因重組的突變基因結構 。 當ES細胞被注入受體胚胎內(nèi)細胞團時 ， 它可參與形成小鼠胚胎的各種組織 ， 形成嵌合體小鼠 。 基因敲除 (gene knockout)是獲得攜帶有特定基因突變個體的技術 ,研究基因在發(fā)育中的功能 . 20世紀 80年代初 ,胚胎干細胞 (embryonic stem cell， ES細胞 )分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術基礎 。 常用的方法包括 基因敲除 或通過 抑制性因子抑制目的基因的功能 ，或通過 轉(zhuǎn)基因技術異位表達目的基因 等。因此，反向遺傳學手段就顯得重要了。 要 確定所得基因就是所要尋找的目的基因 ， 要滿足以下條件 ：首先在該突變體中要檢測到相應的基因突變 ， 并且該突變足以引起該基因的失活或功能異常；其次 ， 該基因的野生型能夠使該突變體表型恢復 (如通過 mRNA注射或轉(zhuǎn)基因等手段 )；第三 ， 在野生型個體中 ， 通過技術手段阻斷該基因的功能 (如通過 RNAi或反義技術 ) ， 該個體應表現(xiàn)出與突變體一致的表型 。 ? 較常用的分子標記檢測手段包括 簡單序列長度多態(tài)性 (simple sequence length polymorphisms,SSLPs)、 限制片段長度多態(tài)性 (restriction fragment length polymorphisms,RFLPs)和 單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphisn SNPs)分析 。 通過分析突變位點與已知分子標記的連鎖關系來確定突變基因的染色體位置 。 對于 化學誘變劑或射線照射引起的突變 ，基因的克隆就困難得多 ,多數(shù)情況下要采用 定位克隆 (positional cloning)的辦法。 ? 獲得感興趣的突變體后 , 就要克隆引起該突變的基因 對于 p因子或病毒載體引起的插人突變 ，基因的克隆 可利用 p因子序列作為探針，從該突變體的基因組文庫中篩選出含有 P一因子的克隆， 從而確定 p因子的插人位點及被阻斷的基因。這類載體具有隨機整合入宿主基因組的能力，也可用于隨機插入誘變篩選。 該方法的不足處是 p因子的插入位點并不是完全隨機的，它不能覆蓋基因組中的全部基因。 這些個體再與野生型個體雜交 ， 其后代中就會含有雜合突變個體 ， 同時 p因子與轉(zhuǎn)座酶基因通常會分離 ， 從而保證其后代突變的穩(wěn)定性 。 p因子介導的插入突變篩選 通過不同品系果蠅的雜交來實現(xiàn) 。 一個完整的 p因子包括轉(zhuǎn)座所需的特殊序列 (包括末端重復序列等 )和一個轉(zhuǎn)座酶編碼基因 。而 F3代中存活但不表現(xiàn)出父本表型的個體為攜帶有平衡染色體的雜合突變體 ,可用于該品系的保存 . (insertional mutagenesis screen) 利用轉(zhuǎn)座子 (transposon)或 病毒載體 作為誘變劑 。在 290C培養(yǎng)時攜帶這一基因的胚胎會死亡 .這樣， 在F2代中，存活個體都有帶有一條平衡染色體和一條可能帶有突變基因的染色體 . F2代雌雄個體間交配產(chǎn)生 F3代個體 . 如果 Fl代中的果蠅個體相應染色體上帶有基因突變，在 F3代個體中就會產(chǎn)生該基因的純合突變體 。 用于進行化學誘變的果蠅品系相應染色體中帶有一個 隱性標記基因 .經(jīng)過化學誘變的雄性個體與攜帶平衡染色體的雌性個體雜交，通過表型檢測挑選 Fl代個體中帶有平衡染色體的雄性個體進行下一步的雜交。 二是該染色體上含有一個顯性標記基因 ，便于鑒別含有該染色體的個體。 在有些情況下突變也可能是獲得功能性的 ，如某些受體或轉(zhuǎn)錄因子可能會由于突變而持續(xù)活化。 導致某一蛋白質(zhì)完全失活的突變稱為無效突變(null mutation)。 誘變篩選通常是通過 射線 或 化學誘變劑 處理父本個體 ,在其生殖系細胞中產(chǎn)生隨機突變，然后與野生型母本個體雜交 ，子一代 (Fl)個體中就有可能攜帶基因突變 ,而每一個體攜帶的基因突變可能都不同于其他個體 . Fl中的每一個體再與野生型個體雜交，所產(chǎn)生的每一子二代 (F2)群體再進行群體內(nèi)的雜交 . 如果 Fl 個體攜帶有基因突變， F2個體中就會有一半個體是雜合突變體，在 F3代中有 1/4的交配組合的后代中就有可能出現(xiàn)純合突變個體而表現(xiàn)出某種發(fā)育異常 . 突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型改變是多種多樣的 ，有的可能十分微弱，需要精細的生化技術才能檢測出與野生型的差別，有的突變可能是致死的。 一是正向遺傳學手段 ,即大規(guī)模隨機誘變 ， 產(chǎn)生發(fā)育異常的 突變 個體，然后再尋找突變的基因。 (二 )發(fā)育遺傳學技術 發(fā)育生物學的基本任務之一是 研究基因在胚胎發(fā)育中的作用 。 細胞內(nèi)標記物 需通過顯微注射導入細胞內(nèi) ， 通過熒光顯微鏡或組織化學方法進行定位 。其缺點是會溶于有機溶劑，不適于需進行組織切片的實驗。 研究胚胎早期卵裂球分化命運 .在胚胎移植實驗中 標記供體或受體組織，在顯微注射實驗中追蹤被注射卵裂球的命運與表型 等 . 早期常用的標記物包括活體染料 尼羅藍 和 中性紅 ，使用方便，價格便宜，但很難標記胚胎內(nèi)部組織，隨胚胎發(fā)育染料會有擴散和衰退現(xiàn)象 . 現(xiàn)在 細胞外標記染料 常用 親脂性 熒光染料 DiI和 標記細胞的細胞膜中 并很好地保存于子代細胞中。 ? GFP的分布可在熒光顯微鏡下直接觀察； lacZ基因編碼 β半乳糖苷酶，可以用特異底物進行顯色而研究其產(chǎn)物分布。 采用一些產(chǎn)物易于檢測的基因(即報道基因， reporter gene)與待研究的表達調(diào)控序列串聯(lián) ,然后通過轉(zhuǎn)基因技術導入胚胎體內(nèi)， 通過分析報道基因產(chǎn)物的表達來研究目的片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性 。 非洲瓜蟾和斑馬魚胚胎可 在解剖鏡下 操作 ， 而小鼠和果蠅胚胎需 在顯微鏡下 操作 。 ? 在 非洲爪瞻和斑馬魚中 , 用于對基因功能的研究和細胞譜系的標記研究 。 ? 原理： 用帶標記物的已知堿基順序的核酸探針與細胞內(nèi)待測核酸 按堿基配對原則 進行特異性原位結合（雜交） ，并通過對標記物的顯示和檢測，而獲知待測核酸的有無及相對量。 標記物有熒光素 （ 熒光顯微鏡觀察 ） 、 辣根過氧化物酶 （ 光鏡或電鏡觀察 ） 、 膠體金 （ 多用于電鏡觀察 ） 免疫組織化學 (辣根過氧化物酶標記 ) 胰島 B細胞呈胰島素陽性 免疫組織化學 (熒光素標記 ) 毛血管內(nèi)皮細胞呈 vWF陽性 ? 聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction， PCR) ， 反轉(zhuǎn)錄 PCR (RT ： PCR) ， Northern印跡雜交 ， Western 印跡雜交 ，免疫共沉淀技術等都常用于發(fā)育生物學研究，如用于 檢測目的基因或蛋白質(zhì)