【正文】 賦有的特性 .有機(jī)體 在不同發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出來(lái)的形態(tài) 、 結(jié)構(gòu) 、 生化等特征稱為表型 。 ③ 可進(jìn)行遺傳學(xué)研究 。 雖然 X. laevis作為動(dòng)物模型有許多優(yōu)點(diǎn) ， 但也存在著重要缺陷 ，即 很難進(jìn)行遺傳學(xué)研究 。 位于囊胚邊緣的細(xì)胞與卵黃并不完全分隔 。 伴隨其發(fā)育 ， 胚胎還形成復(fù)雜的胚外膜系統(tǒng) ， 包括卵黃囊 、 尿囊 等 。 果蠅 是目前遺傳學(xué)背景最清楚的物種 ， 其 基因組序列測(cè)序已全部完成 (約包含 13 600個(gè)基因 )， 相關(guān)遺傳學(xué)研究手段非常完備 ，在長(zhǎng)期的遺傳學(xué)研究過(guò)程中積累了大量遺傳突變品系 ， 為果蠅的發(fā)育遺傳學(xué)研究提供了有利條件 。 胚胎的表皮出現(xiàn)一系列均勻分布的小溝 ， 將胚胎分為 14個(gè)區(qū)域 ， 此時(shí)出現(xiàn)的分節(jié)是 副體節(jié) 。 雄蟲(chóng)則有 1 031個(gè)體細(xì)胞 和約 1 000個(gè)生殖細(xì)胞 . 線蟲(chóng)大致 呈圓柱形 ， 外表覆有角質(zhì)化層 ， 下方為下皮層(hypodermis)， 然后是肌肉 。 在 28細(xì)胞時(shí)期 ， 兩個(gè) E細(xì)胞開(kāi)始向內(nèi)部遷移 ， 此時(shí)可以算作是原腸作用的開(kāi)始 。 ? 最常用的技術(shù)是石蠟切片技術(shù) 。 原位雜交 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈心房鈉尿肽陽(yáng)性 ? 常用于啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子的分析研究。 最 常見(jiàn)的基因突變類(lèi)型是功能喪失 ，即突變后的蛋白質(zhì)比野生型蛋白質(zhì)活性差。 其中一個(gè)品系攜帶有缺陷型的 p因子 ， 而另一個(gè)品系攜帶有轉(zhuǎn)座酶 ， 在其后代個(gè)體生殖細(xì)胞中 ， 轉(zhuǎn)座酶就會(huì)誘導(dǎo) p因子在基因組中的隨機(jī)轉(zhuǎn)座并有可能造成某些基因的突變 。 ? 對(duì)多數(shù)物種來(lái)講，由于其世代周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)管理困難等原因，進(jìn)行大規(guī)模誘變篩選是很困難的。 cre編碼一種重組酶 ， 可以識(shí)別并結(jié)合 loxP位點(diǎn)并切除位于兩個(gè) loxP位點(diǎn)之間的序列 。 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 , dsRNA的長(zhǎng)度超過(guò) 30個(gè)堿基對(duì)時(shí)會(huì)引起非特異性的抗病毒反應(yīng) (如非特異性翻譯抑制和細(xì)胞凋亡 ， 刺激干擾素表達(dá)等 )。 如果干細(xì)胞進(jìn)入到了胚胎的生殖系細(xì)胞中 ， 通過(guò)與正常小鼠雜交 ， 在子二代個(gè)體中就可以獲得帶有轉(zhuǎn)基因的雜合個(gè)體 。 2)功能蛋白質(zhì)組學(xué) (Functional proteinomics)。 6)羊膜穿刺法 (Amniocentesis)。如將轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域替換為轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，將某些信號(hào)傳導(dǎo)受體的膜內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)域缺失等。 雙鏈 siRNA解旋 ， RISC利用其反義鏈識(shí)別同源 mRNA并在配對(duì)區(qū)的中間將目標(biāo) mRNA水解 ,從而導(dǎo)致特異性的基因表達(dá)抑制 . 此外 ， 微小 RNA (micro RNA， miRNA,與 siRNA非常相似 ， 只是產(chǎn)生機(jī)制不同 )還可抑制目標(biāo) mRNA的翻譯 . 人們 已利用 RNAi技術(shù)對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行了全基因組范圍 的基因 功能研究 在線蟲(chóng)中 ， 導(dǎo)入 dsRNA可采用如下 3種方法之一： ① 直接注入線蟲(chóng)的性腺 。基因重組載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化等手段導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中 。目的基因染色體定位的精確程度是定位克隆成功的關(guān)鍵，它取決于巳知染色體分子標(biāo)記的精細(xì)程度并需要足夠大的突變體類(lèi)群。 在果蠅中最 常用的轉(zhuǎn)座子是 p因子 (Pelement) .p因子存在于某些果蠅類(lèi)群中 ， 可隨機(jī)插入基因組中 ， 并可在基因組中移動(dòng) 。 這一問(wèn)題可以從兩個(gè)方向研究。 ? 常用標(biāo)記物有 放射性核素 35S、 32P、 3H和地高辛 ? 顯微注射技術(shù) 可將外源 DNA、 RNA或標(biāo)記物等導(dǎo)人早期胚胎細(xì)胞中 。 利用熒光染料標(biāo)記的特異性抗體或探針 ， 可對(duì)胚胎或細(xì)胞中的特定蛋白或 mRNA的分布進(jìn)行定性和定量研究 。 而 P細(xì)胞后幾次的分裂方式則類(lèi)似干細(xì)胞 ， 即每次分裂后都保持其中一個(gè)細(xì)胞為 P細(xì)胞 ,另外一個(gè)細(xì)胞分別為 EMS, C和 D細(xì)胞 (圖緒 .10)。 線蟲(chóng) 生命周期短 ， 培養(yǎng)簡(jiǎn)單 ， 便于遺傳突變篩選 ， 并可用液氮長(zhǎng)期保存 。 位于 腹溝前后兩端的內(nèi)胚層細(xì)胞也分別內(nèi)陷 ， 分別形成中腸的前部和后部 ，兩者隨后融合形成完整的中腸 。 到 E8. 5天 ， 胚胎的頭褶 (head fold)已相當(dāng)清楚 .胚胎開(kāi)始沿它的長(zhǎng)軸扭轉(zhuǎn) ， 經(jīng)扭轉(zhuǎn)過(guò)程 ， 胚胎被羊膜和羊膜液完全包圍 . 小鼠幼仔在受孕后 19 20天出生 (二 )無(wú)脊椎動(dòng)物模式生物 (Drosophila melanogaster) 果蠅是遺傳學(xué)的經(jīng)典模式生物 ， 已有 100多年的研究歷史 。 隨后一部分細(xì)胞遷移至胚下腔內(nèi)卵黃上方 ， 形成 下胚層 ， 位于表面的胚層為 上胚層 ， 兩者之間為 囊胚腔 。 此后斑馬魚(yú)的研究得到了迅速發(fā)展 。 受精作用引起 皮質(zhì)運(yùn)動(dòng) (cortical rotation) ， 質(zhì)膜下的皮質(zhì)胞質(zhì)相對(duì)于內(nèi)部的胞質(zhì)部分旋轉(zhuǎn)約 30o。 模式動(dòng)物各有優(yōu)缺點(diǎn) ,但都具備一些共同特征： ① 取材方便 。 Weismann進(jìn)一步提出 后代所具有的雙親遺傳特性來(lái)自于生殖細(xì)胞 ， 來(lái)自于兩性配子所攜帶的遺傳特性 。 細(xì)胞的命運(yùn)實(shí)際上是由卵裂時(shí)所獲得的合子核信息早已預(yù)定的 。 (metamorphosis)： 有些動(dòng)物 ， 如兩棲類(lèi)和昆蟲(chóng) ， 在發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷一個(gè) 幼蟲(chóng) （ larva） 階段 ， 然后經(jīng)過(guò) “ 脫胎換骨 ” 的變化發(fā)育為成體的過(guò)程 。 珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和青蛙鰓的形成對(duì)發(fā)育生物學(xué)家來(lái)說(shuō)是同樣正當(dāng)?shù)膯?wèn)題 。 其特征是具有嚴(yán)格的時(shí)間和空間的次序性 ， 這種次序性是由發(fā)育的遺傳程序控制 ， 發(fā)育是有機(jī)體的各種細(xì)胞協(xié)同作用的結(jié)果 ,也是一系列基因網(wǎng)絡(luò)性調(diào)控的結(jié)果 . 發(fā)育完成兩大功能： 。 其共同點(diǎn)都 認(rèn)為胚胎是成體的雛形 ， 是配子中本來(lái)固有的結(jié)構(gòu) ,胚胎發(fā)育僅僅是原有結(jié)構(gòu)的增大 。 由此他 認(rèn)為蛙的 胚胎發(fā)育存在嵌合型發(fā)育機(jī)制 ， 細(xì)胞的特征和命運(yùn)是在卵裂的過(guò)程中決定的 。 由基因型控制發(fā)育 ， 同時(shí)有機(jī)體的表型又受到環(huán)境因子與基因型的共同影響 。 上述物種中果蠅 、 線蟲(chóng)和斑馬魚(yú)均可用于大規(guī)模遺傳突變研究 ， 小鼠的基因敲除技術(shù)已相當(dāng)完善 ， 非洲爪瞻的轉(zhuǎn)基因技術(shù)較有優(yōu)勢(shì) 。 主要是由于其 生命周期過(guò)長(zhǎng) ， 同時(shí) ，X. laevis是異源四倍體 ， 多數(shù)基因都存在 4個(gè)拷貝 ， 很難進(jìn)行遺傳突變實(shí)驗(yàn) 。 到囊胚期 ，這些細(xì)胞與卵黃細(xì)胞融合 ， 形成一個(gè)合胞體層 ， 稱為 卵黃合胞體層 (yolkl syncytial layer， YSL)。 卵黃囊為胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng) ，而尿囊是胚胎的呼吸器官并貯存代謝廢物 。 果蠅在 25 0C下 由卵至成蟲(chóng)約需 11天 ， 經(jīng)過(guò)卵 、 幼蟲(chóng) 、 蛹和成蟲(chóng) 4個(gè)階段 。 副體節(jié)與后來(lái)的體節(jié)在位置上并不對(duì)應(yīng) ， 每一體節(jié)包含前一副體節(jié)的后 2/3與后一副體節(jié)的前 1/3。 消化系統(tǒng)包括咽和腸道 。 隨后由 C和 D細(xì)胞產(chǎn)生的肌細(xì)胞 和由 ABa細(xì)胞產(chǎn)生的咽 細(xì)胞也依次由腹裂 (ventral cleft)卷入胚胎內(nèi)部 。 石蠟切片術(shù) (paraffin sectioning)： 取材 、 固定 、 脫水 、 包埋 、 切片 (5～ 10181。 采用一些產(chǎn)物易于檢測(cè)的基因(即報(bào)道基因， reporter gene)與待研究的表達(dá)調(diào)控序列串聯(lián) ,然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入胚胎體內(nèi)， 通過(guò)分析報(bào)道基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)研究目的片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性 。 導(dǎo)致某一蛋白質(zhì)完全失活的突變稱為無(wú)效突變(null mutation)。 這些個(gè)體再與野生型個(gè)體雜交 ， 其后代中就會(huì)含有雜合突變個(gè)體 ， 同時(shí) p因子與轉(zhuǎn)座酶基因通常會(huì)分離 ， 從而保證其后代突變的穩(wěn)定性 。因此，反向遺傳學(xué)手段就顯得重要了。 進(jìn)行條件基因敲除 需構(gòu)建兩個(gè)小鼠品系 ， 在其中 一個(gè)品系中在靶基因兩側(cè)都插入 loxP位點(diǎn) ， 在另一個(gè)品系中需要轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動(dòng)子控制的 cre基因 。 人們采用了多種方法來(lái)避免這一問(wèn)題 。 通過(guò)子二代自交就可以獲得純合的個(gè)體 。 3) 生物制藥 。 5)人先天缺失 (Human birth defects)。 顯性抑制型蛋白是 通過(guò)某種修飾或加工，可以抑制野生型蛋白功能的缺陷型蛋白 。 siRNA進(jìn)而結(jié)合到一種蛋白復(fù)合體中 ， 形成 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA induced silencing plex， RISC)。 在基因突變片段兩側(cè)應(yīng)帶有足夠長(zhǎng)的與內(nèi)源基因相同位置同源的序列以利于同源重組的發(fā)生 。 通過(guò)分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來(lái)確定突變基因的染色體位置 。而 F3代中存活但不表現(xiàn)出父本表型的個(gè)體為攜帶有平衡染色體的雜合突變體 ,可用于該品系的保存 . (insertional mutagenesis screen) 利用轉(zhuǎn)座子 (transposon)或 病毒載體 作為誘變劑 。 (二 )發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù) 發(fā)育生物學(xué)的基本任務(wù)之一是 研究基因在胚胎發(fā)育中的作用 。 ? 原理： 用帶標(biāo)記物的已知堿基順序的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸 按堿基配對(duì)原則 進(jìn)行特異性原位結(jié)合（雜交） ，并通過(guò)對(duì)標(biāo)記物的顯示和檢測(cè)，而獲知待測(cè)核酸的有無(wú)及相對(duì)量。 某些熒光物質(zhì)(如熒光標(biāo)記染料或熒光蛋白 )在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下會(huì)發(fā)出熒光 。AB細(xì)胞繼續(xù)分裂為 ABa和 ABp細(xì)胞 。 線蟲(chóng)成蟲(chóng)僅 約 1mm長(zhǎng) ， 構(gòu)造簡(jiǎn)單 ， 全身透明 ， 細(xì)胞數(shù)目少 ， 發(fā)育中的 細(xì)胞譜系 (cell lineage)幾乎固定 ， 易于追蹤 。 位于 外胚層最腹側(cè)的 預(yù)定神經(jīng)母細(xì)胞逐漸陷入胚胎內(nèi)部 ， 發(fā)育為神經(jīng)組織 。 隨后原條回縮 ,胚胎開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)板 、 脊索 、 體節(jié)等 。 受精卵經(jīng)卵裂形成 胚盤(pán) ， 胚盤(pán)中央逐漸與卵黃分離 ， 形成 胚下腔 。 此次篩選成為斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域的里程碑 。 受精時(shí)精子于動(dòng)物半球的任意位點(diǎn)人卵 。 對(duì)于發(fā)育分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)也主要來(lái)源于對(duì)這些模式生物的研究 。 因此 發(fā)育也必然是逐漸變化的過(guò)程 .在胚胎發(fā)育中 ,通過(guò)受精卵的分裂 產(chǎn)生許多新細(xì)胞和新的細(xì)胞類(lèi)型 . 到 19世紀(jì) 40年代 ， 對(duì)卵子的特性開(kāi)始有所認(rèn)識(shí) ， 認(rèn)識(shí)到卵子也是一個(gè)細(xì)胞 （ 一個(gè)特殊細(xì)胞 ） 。 他 認(rèn)為合子的細(xì)胞核含有大量特殊的信息物質(zhì) ——決定子 (determinants),在卵裂的過(guò)程中被平均分配到子細(xì)胞中去控制子細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn) 。 （ angenesis） ： 三胚層的細(xì)胞相互作用分化形成各種不同器官的原基 。 4. 發(fā)育生物學(xué)研究有機(jī)體細(xì)胞的每一個(gè)分子 、 每一個(gè)細(xì)胞 、 每一種組織 、 每