【正文】 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)研究，如顯微注射、胚胎切割和移植等。 動(dòng)物極含有大量色素顆粒而卵黃較少 ， 植物極則含有豐富的卵黃而色素顆粒較少 。 蝌蚪在 5天 左右后肢開始發(fā)育并逐漸進(jìn)入變態(tài)期 ， 到 2個(gè) 月時(shí)完成變態(tài) 。 近年來 ， 另一個(gè) X. laevis的近緣品種一 的視野 。 在 X. laevis中建立的實(shí)驗(yàn)方法均可直接應(yīng)用于 X. tropicalis中 。 90年代 ， 由 Nilsslein Volhard C和 Driever W分別領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室開展了斑馬魚的大規(guī)模突變篩選 ， 得到了大約 4000個(gè)突變品系 。 斑馬魚是目前唯一可以進(jìn)行大規(guī)模遺傳突變篩選的脊椎動(dòng)物 . 斑馬魚的 基因組測序已接近完成 ，相關(guān)的遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)研究技術(shù)也比較完善，斑馬魚已成為 最好的脊椎動(dòng)物發(fā)育遺傳學(xué)研究體系 之一 . 斑馬魚的卵屬于 端黃卵 ， 胚盤位于卵黃之上 。 到囊胚晚期， 卵黃合胞體層與胚盤開始向下包被 。 ：雞 雞的胚胎發(fā)育過程與哺乳動(dòng)物更為接近 . 由于雞胚 在體外發(fā)育 ， 相對(duì)于哺乳動(dòng)物更容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究 ， 相應(yīng)的 研究手段已比較成熟 。 卵細(xì)胞質(zhì)和核位于卵黃上方 23mm的狹小區(qū)域 。 預(yù)定中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞通過原條中央的 原溝 遷入囊胚腔內(nèi)部 即原腸作用 。 雞胚在孵育 21天后孵化成為小雞 ：小鼠 胚胎發(fā)育過程與人類比較接近 ，作為很多人類疾病的動(dòng)物模型 小鼠的 世代周期約 2個(gè)月 ，這在哺乳動(dòng)物中是相當(dāng)短的。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將發(fā)育成為胚胎本身 ， 而滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胚外組織 。 胚胎的預(yù)定中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞通過原條遷入胚胎內(nèi)部 。 1980年初 ，德國科學(xué)家 NessleinVolhard C和美國學(xué)者 Weichaus E以果蠅作為材料 ， 研究發(fā)育調(diào)控的遺傳基礎(chǔ) ， 他們和另一位美國遺傳學(xué)家 Lewis E B分享 了 1995年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 。 果蠅卵呈長橢圓形 ， 精子通過卵殼前部的卵孔入卵 .其 胚胎發(fā)育很快 ， 受精卵在 24h內(nèi)就可以孵化為幼蟲 . 卵裂為 表面卵裂 。 這些細(xì)胞將遷移至外胚層下 ， 發(fā)育成為肌肉和其他結(jié)締組織 。 胚帶 包含了外胚層和位于其下方的中胚層組織 ， 將來 形成胚胎的主體結(jié)構(gòu) ， 也是將要分節(jié)的部分 。 隨著原腸作用的進(jìn)行 ， 胚帶開始延伸 ， 胚帶后端不斷向背側(cè)延伸并折向前方 。 副體節(jié)在胚胎發(fā)育中的出現(xiàn)是短暫的 ， 但它奠定了胚胎軀體結(jié)構(gòu)劃分的基礎(chǔ) ， 也是許多分節(jié)基因表達(dá)區(qū)域的基本單位 。 果蠅的 3 齡幼蟲化成蛹 ， 在激素刺激下發(fā)生變態(tài) ， 由幼蟲變?yōu)槌上x 。 2. 線蟲：秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans) 英國科學(xué)家 Sydney Brenner在 20世紀(jì) 60年代開始選擇線蟲作為發(fā)育生物學(xué)模式動(dòng)物 ， 他 與其合作者 H Robert Horvitz和 John E Sulston獲得了 2022 年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 。 雌雄同體個(gè)體可通過自體受精產(chǎn)生后代 ， 也可與雄性個(gè)體交配異體受精 。 其體腔為假體腔 ， 體腔周圍沒有中胚層細(xì)胞包被 。 卵子在產(chǎn)出的過程中受精 ， 在排出母體時(shí)通常處于卵裂階段 (約 40個(gè)細(xì)胞 )。 精子入卵引起卵質(zhì)的重組 ， 受精卵中間部分出現(xiàn)一個(gè) “ 分裂溝 ” ， 但此時(shí)并不真正分裂 ， 稱為 “ 假卵裂 ” ( pseudocleavage) .合子卵裂為 不對(duì)稱卵裂 (圖緒 .10) 第一次卵裂后前部的細(xì)胞為 AB細(xì)胞 ， 而后段的細(xì)胞稱為 P細(xì)胞 。 EMS細(xì)胞繼續(xù)分裂為一個(gè) E細(xì)胞和一個(gè) MS細(xì)胞 .E細(xì)胞將發(fā)育為內(nèi)胚層細(xì)胞 。 胚胎的腹裂相當(dāng)于胚孔 。除了常規(guī)的光學(xué)顯微鏡外，一些特殊的顯微鏡也廣泛用于發(fā)育生物學(xué)研究。 掃描電鏡術(shù) ： 不需要制備切片，組織塊 (約 )用戊二醛 和餓酸 固定，經(jīng)脫水干燥，表面噴鍍薄層碳與金屬膜，觀察 . 激光掃描共聚焦顯微鏡 (laser scanning confocal microscope)是 20世紀(jì) 80年代初研制成功的一種高光敏度 、 高分辨率的新型儀器 ，近年來在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用 . 共聚焦顯微鏡 是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 。 共聚焦顯微鏡技術(shù)很好地解決了這一問題 。m 厚 )(連續(xù)切片 ） 、 貼片 、 脫蠟 、 染色 、 觀察 蘇木精 伊紅染色法 (hematoxylineosin staining， HE染色法 )： 蘇木精為堿性染料 ， 使染色質(zhì)和核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料使胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)著紅色 冷凍切片 是利用特殊的低溫包埋劑對(duì)樣品進(jìn)行包埋 ， 在低溫條件下進(jìn)行切片的技術(shù) 。 當(dāng)把人或動(dòng)物的某種肽或蛋白質(zhì)作為抗原注入另一種動(dòng)物 ， 其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該抗原的特異性抗體 (免疫球蛋白 )。 ? 核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)， 檢測基因 （ DNA片段） 的有無、基因的表達(dá)活性 （ mRNA） 。 ? 在 果蠅和小鼠 中 ， 常用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建 . ? 由于 不同動(dòng)物胚胎大小差異很大 ， 顯微注射所需顯微操作系統(tǒng)也有所差異 。 ? 常用的報(bào)道基因有 綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)和 lacZ基因 。在紫外線照射下，DiI會(huì)發(fā)出 紅色 熒光 ，而 DiO會(huì)發(fā)出 綠色 熒光 。在顯微注射實(shí)驗(yàn)中，較 常用的示蹤基因是 GFP和 lacZ基因 ，即將 GFP或 lacZ mRNA與要研究的活性物質(zhì)共同注射入胚胎卵裂球中，通過觀察胚胎中 GFP或 β半乳糖苷酶的分布來確定獲得注射物質(zhì)的組織。 二是反向遺傳學(xué)方法，即通過功能喪失 (loss of function)或 功能獲得 (gain of function)方法對(duì)已知基因進(jìn)行功能研究。 有時(shí)同一基因會(huì)出現(xiàn)一系列不同程度的功能喪失性突變 。 三是在純合狀態(tài)下是致死的 。如果該突變不致死，相應(yīng)個(gè)體就會(huì)出現(xiàn)父本個(gè)體所攜帶的隱性表型；如果是致死的就要檢查死亡胚胎所出現(xiàn)的表型。 在插入突變篩選中 采用的 P因子是缺陷型的 ， 缺乏有功能的轉(zhuǎn)座酶基因 。這些雜合突變體再通過近交就可以獲得純合突變體并加以研究 。這一方法在小鼠和斑馬魚中應(yīng)用較多。 ? 定位克隆是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因分離 。 通過這些手段通?？梢詫⑼蛔兓蚨ㄎ坏綆装偾A基的范圍內(nèi) .下一步的任務(wù)是 獲取該染色體片段的基因組序列 . 獲取相應(yīng)序列后 ， 再 通過生物信息學(xué)等手段確定該片段可能含有的基因 ， 并根據(jù)這些基因的可能功能及該突變體的表型等初步判斷導(dǎo)致該突變的候選基因 ， 最后通過實(shí)驗(yàn)手段予以確認(rèn) 。 ? 反向遺傳學(xué) 通過對(duì)已知基因進(jìn)行功能缺失或過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究胚胎個(gè)體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。 小鼠胚胎干細(xì)胞取自小鼠胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán) ， 可在體外連續(xù)培養(yǎng)而保持其分化全能性 。 用抗藥性基因 [常用的是新霉素 (neomycin)抗性基因 ]取代目的基因中含有起始密碼子的外顯子部分 ， 使目的基因完全失活 。 經(jīng)過分子生物學(xué)手段確定這些細(xì)胞攜帶有正確重組的基因后 ， 就可以 將這些干細(xì)胞注射入胚胎中以獲得嵌合體小鼠 . (condition knockout) 許多重要調(diào)控基因同時(shí)參與胚胎發(fā)育的許多過程 ， 在傳統(tǒng)的完全基因敲除小鼠胚胎中是早期致死的 ， 而無法研究該基因在晚期胚胎發(fā)育或特定組織中的功能 。 將兩個(gè)小鼠品系進(jìn)行雜交 ， 在其后代中 ,cre會(huì)在特定組織中表達(dá) ， 且靶基因會(huì)被 Cre切除而失活 ， 實(shí)現(xiàn)組織特異性的基因敲除 (圖緒 . 16). 由于 Cre的作用效率并不能達(dá)到 100%， 在實(shí)際操作中 loxP品系小鼠通常采用雜合體 ， 即把基因中的一個(gè)拷貝帶有 loxP位點(diǎn) ， 另一拷貝是失活的 ， 以保證條件基因敲除的效率 . Crelox系統(tǒng)也可用于基因的組織特異性激活實(shí)驗(yàn) 。 1998年 ， Fire A等 發(fā)現(xiàn)將雙鏈 RNA (dsRNA)注入線蟲 ， 可以誘導(dǎo)特異性的基因表達(dá)沉默 (gene silencing)。 RNAi的作用機(jī)制 如圖緒 .17所示 在 RNAi過程中 ， 長的 dsRNA首先被二種 RNA酶 Ⅲ (Dicer)裂解為 2123個(gè)核苷酸的小干擾 dsRNA(small interfering RNA， siRNA)， 這些 siRNA帶有 5’端磷酸基團(tuán)和 3’端的羥基 ， 3’末端帶有 23個(gè)突出的核苷酸 。 ③ 用攜帶RNAi表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌喂食線蟲 。 一是采用化學(xué)合成的 2123個(gè)核苷酸的 siRNA；二是采用 siRNA表達(dá)載體 ， 目前較為常用的 SiRNA表達(dá)載體中采用的是 RNA聚合酶 Ⅲ 啟動(dòng)子 .表達(dá)siRNA 的一種策略是通過兩個(gè)串聯(lián)的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄形成siRNA的正義和反義鏈 ， 兩者直接互補(bǔ)成為 siRNA。 MO 是一種非離子型 DNA類似物 ， 它 以嗎琳環(huán)取代了 DNA 中的脫氧核糖 ，以非離子性的磷酸二酰胺鍵取代了 DNA鏈中的磷酸二酰鍵 (圖緒 . 18)。 (dominapt negative) 通過過量表達(dá)顯性抑制型蛋白以阻斷內(nèi)源蛋白活性 ，研究其可能功能。 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠有兩種技術(shù)路線： 一種是 將外源基因直接注射到受精卵的細(xì)胞核中 ， 這種方法的缺點(diǎn)是無法控制外源基因的插入情況 ， 只能通過對(duì)小鼠后代基因組 DNA的 PCR或 Southern印跡雜交手段檢測 。 在非洲爪瞻常采用的轉(zhuǎn)基因方法是 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合方法(restrictionenzymemediated integration, REMI). 基本過程： 將精子細(xì)胞核與線性化的外源 DNA孵育 ， 同時(shí)加入卵提取物使精子染色體去致密化 ， 并加入少量限制性內(nèi)切酶輕度酶解精子染色質(zhì)以促進(jìn)外源 DNA的插入 。 ? 為了避免轉(zhuǎn)入基因在基因組中的轉(zhuǎn)座 ， 轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中 采用的果蠅品系是缺乏內(nèi)源 p因子的 ， 轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中的 p因子也是缺陷型的 ， 它不包含轉(zhuǎn)座所必需的轉(zhuǎn)座酶基因 。 4)畸胎學(xué) (Teratology)。 8)胚胎干細(xì)胞 ( Embryonic Stem Cells。 4) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 (Signal transduction pathways)。 8)農(nóng)牧漁業(yè) (Agriculture). 生物制藥 干細(xì)胞