【正文】 5. MFISH的。3. 簡(jiǎn)述臨床診斷常用的FISH探針的類型及用途。A. 染色體微缺失B. 21三體C. 男性胎兒D. 正常女性胎兒7． 熒光素FITC是_______。針對(duì)該檢測(cè)結(jié)果判斷疾病為_(kāi)______。請(qǐng)根據(jù)該結(jié)果得出診斷為_(kāi)______。左圖顯示細(xì)胞核與13號(hào)染色體（綠）和21號(hào)染色體（紅）的探針雜交。3． 固相雜交不包括_______。A. Southern blot B. Northern blot C. Western blot D. 原位分子雜交2． 核酸的變性是_______。QA則是覆蓋更廣范圍的活動(dòng)，包括樣本收集、結(jié)果報(bào)告和解釋等。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)測(cè)定由一系列步驟組成，包括樣本收集、樣本處理（核酸提取）、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果報(bào)告及解釋等。此外，上述四個(gè)工作區(qū)域內(nèi)還應(yīng)有固定于房頂?shù)淖贤鉄?，以便于工作后區(qū)域內(nèi)的空氣照射。進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按單一方向進(jìn)行，即試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如果采用全自動(dòng)擴(kuò)增儀，后兩個(gè)區(qū)域可以合并。由于基因擴(kuò)增檢驗(yàn)是對(duì)靶核酸的指數(shù)倍擴(kuò)增過(guò)程，因而有大量的擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)，這種擴(kuò)增產(chǎn)物極易對(duì)以后的新擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生“污染”，為防止這種污染的發(fā)生，就需要對(duì)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)。（1）PCR在病原微生物的檢測(cè)中的應(yīng)用；（2）PCR在遺傳病中的應(yīng)用；（3）PCR在腫瘤中的應(yīng)用；（4）其它方面的應(yīng)用：PCR技術(shù)除用于臨床診斷和治療外，還可用于DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系識(shí)別、法醫(yī)物證等。利用bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)可在每個(gè)靶序列上結(jié)合60～300個(gè)酶分子，而且所有雜交反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，觀察到的信號(hào)與靶DNA的量成正比，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線將靶DNA定量。bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)包括四種雜交探針，即目標(biāo)探針、前放大體、 放大體和標(biāo)記探針。分枝DNA是人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段，在每個(gè)側(cè)鏈上都可以標(biāo)記可被激發(fā)的標(biāo)記物。因此，Ct值的引入確保了實(shí)時(shí)熒光PCR定量的精確和嚴(yán)格。2．試證明Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。連接產(chǎn)物變性后，又可作為引物的模板參加反應(yīng)，使擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)變性復(fù)性（退火）連接的20～30個(gè)循環(huán)，檢測(cè)連接反應(yīng)的產(chǎn)物。模板雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對(duì)引物分別與模板鏈復(fù)性退火，復(fù)性后引物A和B′的3′端分別與引物B和A′的5′端相鄰。LCR擴(kuò)增對(duì)象不是目標(biāo)片段，而是由引物組成的探針，是一種探針擴(kuò)增技術(shù)。探針與靶序列雜交后，發(fā)夾展開(kāi)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開(kāi)，熒光得以恢復(fù)，熒光檢測(cè)系統(tǒng)即可接收到熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)13．LCR：連接酶鏈反應(yīng)又稱為連接酶擴(kuò)增反應(yīng)。12．分子信標(biāo)：分子信標(biāo)探針是TaqMan探針的一種衍生方法。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→5′外切酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，如FAM、VIC等，3′端標(biāo)有熒光淬滅基團(tuán)，如TAMRA等。11．TaqMan探針：在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)引物和一條探針。10．循環(huán)閾值：循環(huán)閾值是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。首先分離總RNA或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA的3′端上加上poly(dG)尾，與此poly(dG)相對(duì)應(yīng)的錨定引物為poly(dC)，為保證擴(kuò)增特異性，poly(dC)應(yīng)在十二聚以上，5′端還可帶上某些限制性酶序列或其他序列信息。因PCR反應(yīng)中使用二種引物濃度不同，因此稱為不對(duì)稱PCR。巢式PCR最大的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度大大提高7．不對(duì)稱PCR：不對(duì)稱PCR的目的是擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。多重PCR對(duì)于檢測(cè)疾病相關(guān)基因十分龐大的疾病很有價(jià)值。每對(duì)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物序列長(zhǎng)短不一。其原理是：用限制性內(nèi)切酶消化DNA片斷，然后用連接酶將酶切產(chǎn)物連接成環(huán)狀，再用已知序列上兩端相反方向的引物進(jìn)行PCR。其原理是先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。2．原位PCR：是指直接用細(xì)胞涂片或石蠟片包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)含該特異序列的細(xì)胞的一種方法。參考答案一、A型選擇題1．D 2．E 3．B 4．D 5．B6．B 7．A 8．D 9．A 10．AX型題：1．ABCD 2．ABCE 3．ABDE二、名詞解釋1．聚合酶鏈反應(yīng)：PCR是利用DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在體外條件下，催化一對(duì)引物間的特異DNA片斷合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)。5．臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)如何設(shè)置。3．簡(jiǎn)述bDNA信號(hào)放大系統(tǒng)的原理。具體可用于基因診斷：基因診斷是從基因水平上檢測(cè)人類遺傳性疾病的基因缺陷；基因治療：是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過(guò)載體導(dǎo)入人體靶細(xì)胞取代靶細(xì)胞中的缺陷基因，從而達(dá)到治療疾病目的的方法；基因工程藥物、疫苗和抗體的研究和制備；利用基因敲除或轉(zhuǎn)基因技術(shù)可改造生物、培育新的生物品種或用于藥物篩選和新藥評(píng)價(jià)等。載體DNA在限制酶切割后，用堿性磷酸酶處理，除去5’端磷酸基，以避免載體DNA自身環(huán)化。目的基因和載體可由同一種限制酶切割后產(chǎn)生，或由不同的限制酶切割形成互補(bǔ)黏性末端，經(jīng)退火，彼此間很容易按堿基配對(duì)原則形成氫鍵。經(jīng)重組的DNA分子能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)。重組DNA是在體外利用限制性內(nèi)切酶，將不同來(lái)源的DNA分子進(jìn)行特異的切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體連接，從而組成一個(gè)新的DNA分子。 理想質(zhì)粒載體應(yīng)具備①具有松弛型復(fù)制子；②在復(fù)制子外存在幾個(gè)單一的酶切位點(diǎn)；③具有插入失活的篩選標(biāo)記；④分子量相對(duì)較小，有較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒具有復(fù)制和控制機(jī)構(gòu)，能夠在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立自主的進(jìn)行自身復(fù)制，并使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)。 若重組噬菌體DNA被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運(yùn)載體，將頭部重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，這一過(guò)程成為轉(zhuǎn)導(dǎo)，通常成為感染。 把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體細(xì)胞的過(guò)程成為轉(zhuǎn)化。黏粒又稱柯斯質(zhì)粒，是一種λ噬菌體以為基礎(chǔ)，專門(mén)為克隆大片段而設(shè)計(jì)并和質(zhì)粒共同構(gòu)建的雜合載體。載體按照基本組成元件的來(lái)源不同，可分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、噬菌粒載體、粘粒載體、人工染色體載體等。它是一類專一性很強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶，在基因的分離、DNA結(jié)構(gòu)的分析、載體的改造以及體外重組中均有重要作用。 舉例說(shuō)出重組DNA技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。正確的順序是（ ）A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①②二、名詞解釋 限制性核酸內(nèi)切酶 載體 黏粒 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)導(dǎo)三、問(wèn)答題 簡(jiǎn)述質(zhì)粒的概念和特性，常用的質(zhì)粒載體有哪幾種？ 簡(jiǎn)述重組DNA技術(shù)的原理及技術(shù)。重組DNA技術(shù)一、選擇題下列有關(guān)重組DNA技術(shù)的敘述，正確的是（ 　）A．重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶和運(yùn)載體B．所有的限制酶都只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列C．選細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因?yàn)榧?xì)菌繁殖快D．只要目的基因進(jìn)入了受體細(xì)胞就能成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)下列不屬于獲取目的基因的方法是（ ?。〢．“鳥(niǎo)槍法”B．轉(zhuǎn)錄法C．反轉(zhuǎn)錄法D．根據(jù)已知氨基酸序列合成法作為基因的運(yùn)輸工具運(yùn)載體，必須具備的條件之一及理由是（　 ）A．能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來(lái)并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B．具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C．具有某些標(biāo)記基因，以便為目的基因的表達(dá)提供條件D．能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選基因治療是把健康的外源基因?qū)耄??。〢．有基因缺陷的DNA分子中B．有基因缺陷的染色體中C．有基因缺陷的細(xì)胞器中D．有基因缺陷的細(xì)胞中應(yīng)用重組DNA技術(shù)診斷疾病的過(guò)程中必須使用基因探針才能達(dá)到檢測(cè)疾病的目的。3. 簡(jiǎn)述哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA抽提的主要方法有哪幾種？[本題答案]哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA抽提的主要方法有： 酚提取法、甲酰胺解聚法 、玻棒纏繞法和異丙醇沉淀法、磁珠吸附法等。3）SDS裂解法：它是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，再用SDS裂解去壁細(xì)菌，從而溫和地釋放出質(zhì)粒DNA到等滲溶液中，然后用酚/氯仿抽提。對(duì)CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，CCC質(zhì)粒DNA可重新回復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA。它是一種適用范圍很廣的方法，能從所有的大腸桿菌（）菌株中分離出質(zhì)粒DNA，制備量可大可小。 [答案] 質(zhì)粒DNA提取的方法包括堿裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的核酸酶對(duì)核酸的生物降解，而破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，使用EDTA、檸檬酸鹽并在低溫條件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性；并盡可能地抑制RNA酶的活性。問(wèn)答題1. 在核酸的分離和純化過(guò)程中，如何保持核酸的完整性？[本題答案] 為了保證核酸的完整性，首先在操作過(guò)程中，應(yīng)盡量簡(jiǎn)化操作步驟，減少各種破壞核酸的有害因素，包括物理、化學(xué)與生物學(xué)的因素。目前主要有透析袋電泳洗脫法與非透析袋電泳洗脫法兩大類。g/ml雙鏈DNAE A260 / [本題答案] B，將整個(gè)操作過(guò)程的pH盡可能控制在 A 2～3 B 4～10C 10～11D 11～12E 12～14[本題答案] B，下列說(shuō)法是正確的A 純DNA的A270/B 純DNA的A260/C 純DNA的A260/D 純DNA的A270/E 純DNA的A230/ [本題答案] B，提示無(wú)RNA的降解時(shí)應(yīng)A 28S RNA的熒光強(qiáng)度約為18S的2倍B 18S RNA的熒光強(qiáng)度約為28S的2倍C 5S RNA的熒光強(qiáng)度約為18S的2倍D 5S RNA的熒光強(qiáng)度約為28S的2倍E 28S RNA的熒光強(qiáng)度約為5S的2倍[本題答案] AA mRNAB 28SrRNAC 18SrRNAD 5SrRNAE [本題答案] A13. 以下哪項(xiàng)有利于DNA的保存 A 溶于TE中DNA在室溫可儲(chǔ)存數(shù)年B 加入少量DNase C 溶于pH D 加入少量DNase和RNase E 在DNA樣品中加入少量氯仿，可有效避免細(xì)菌污染[本題答案] E14. 酚抽提法可用于高分子量DNA的分離純化，所用試劑分別有不同的功能，下列正確的是 A SDS為 陽(yáng)離子去污劑，主要引起細(xì)胞膜的降解并能乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)B EDTA為二價(jià)金屬離子螯合劑，可促進(jìn)DNase的活性 C 蛋白酶K只可消化K類蛋白質(zhì) D 酚可使蛋白質(zhì)變性沉淀 E 無(wú)RNase的DNase可有效地水解RNA [本題答案] C15. 下列哪種不是對(duì)核酸分子完整性進(jìn)行鑒定的方法 A 凝膠電泳法 B Northern雜交C ELISAD Western blottingE 生物芯片技術(shù)[本題答案] D16. 下列哪種方法不是分離純化高分子量DNA的 A 酚抽提法B 煮沸裂解法C 甲酰胺解聚法D 玻棒纏繞法E 異丙醇沉淀法[本題答案] B17. 下列哪種不是從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法 A DEAE纖維素膜插片電泳法B 電泳洗脫法C 冷凍擠壓法D 低熔點(diǎn)瓊脂糖挖塊回收法E 漂洗法 [本題答案] E A DEAE纖維素膜插片電泳法B 非透析袋電泳洗脫法C透析袋電泳洗脫法D 壓碎與浸泡法E 冷凍擠壓法[本題答案] C~5kb的DNA片段的方法是 A DEAE纖維素膜插片電泳法B 非透析袋電泳洗脫法C透析袋電泳洗脫法D 壓碎與浸泡法E 冷凍擠壓法[本題答案] A A DEAE纖維素膜插片電泳法B 非透析袋電泳洗脫法C透析袋電泳洗脫法D 壓碎與浸泡法E 冷凍擠壓法[本題答案] D21. 大多數(shù)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一般為 A 單鏈線性DNAB 雙鏈線性DNAC 閉合環(huán)狀單鏈DNAD 閉合環(huán)狀雙鏈DNAE DNARNA雜交體[本題答案] D22. 目前使用較為廣泛的質(zhì)粒DNA小量提取的方法是 A牙簽少量制備法B 小量一步提取法C SDS裂解法D 堿裂解法E 煮沸裂解法[本題答案] D23. 有關(guān)煮沸裂解法提取質(zhì)粒DNA的正確敘述是 A 該法是一種條件比較溫和的物理方法B 煮沸能完全滅活核酸內(nèi)酶A C D 適用于HB101菌株 E 適用于15kb的質(zhì)粒DNA制備[本題答案] E24. CsCl2EB法中在過(guò)量EB存在的下，超速離心后密度最大沉于管底的是 A 蛋白質(zhì)B 帶切口的環(huán)狀或線性DNAC RNAD 復(fù)合糖類 E 閉環(huán)質(zhì)粒DNA[本題答案] C25. 用柱層析法純化質(zhì)粒DNA時(shí)DNA的何種殘基與硅基質(zhì)結(jié)合 A 嘌呤B 磷酸鹽殘基C 嘧啶D 糖基E 氫離子[本題答案] B26. 在RNA純化時(shí)，常使用的水飽和酚的pH值為 A B C D E [本題答案] B27. 分離與純化mRNA可采用下列哪種方法 A oligo(dT)纖維素柱層析法B oligo(dA)