zhou目的蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測(cè)(參考版)
2025-05-10 12:14本頁(yè)面
【正文】 ? 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 凝膠染色 作業(yè) ? 按要求認(rèn)真撰寫報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)用品及藥品、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 ? 脫染：將染液回收，凝膠先用蒸餾水漂洗一次，浸入脫染液中脫染，室溫浸泡凝膠或 37℃ 加熱使其脫色，更換幾次脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止。 ? 能夠檢測(cè)出大于 。 3. 1塊膠可以用 10 ml離心管， 2塊膠要使用小三角瓶便于混勻，配制 后余液可暫時(shí)留存，便于參考膠凝固時(shí)間，一般 30min即可。 SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝膠配制（ mini VE） 12％分離膠 5%濃縮膠 H2O ml 30%丙稀酰胺 ml Tris 緩沖液 ml（ ） 375ul （ ） 10%SDS 75 ul 30ul 10%過硫酸銨 75 ul 30ul TEMED 3 ul 3ul 注： 1 . 丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時(shí)要小心，操作請(qǐng)務(wù)必戴手套。 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè) 6 ） 將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，并用凡士林封邊 ,安裝好 7 ） 配 12%分離膠，將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽 高三分之二處，加蒸餾水密封。 。 3）吸出 1ml未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物放在一個(gè)微量離心管中，室溫高速離心 1min，沉淀懸浮于 100ul PBS中，加入溶菌酶（終濃度 1mg/ml）37度消化。 ）， 四甲基乙二銨（ TEMED可以催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而加速丙烯酰胺凝膠的聚合 ） ? 1XTris甘氨酸電泳緩沖液： 25mM Tris, 250mM 甘氨酸， % SDS ? 1xSDS上樣緩沖液： 50mM TrisHCl（ ），100mM DTT， 2% SDS， 10% 甘油， % 溴酚藍(lán) ? 染色液： 90甲醇： 90冰乙酸： 20水＋ R250 ? 脫色液： 90甲醇： 90冰乙酸： 20水 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 培養(yǎng) ? 誘導(dǎo) ? 樣品制備 ? SDSPAGE ? 凝膠檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)步驟 1）挑取單菌落，接入 3ml含氨芐青霉素（ 50ug/ml）的 LB培養(yǎng)液， 37℃ 培養(yǎng)過夜。 SDS最終使蛋白質(zhì)變成具有高負(fù)電荷的線狀分子。 SDS 分子的極性區(qū) (洋紅色圓點(diǎn) )，則露在外面，以增加親水性。解離后的氨基酸側(cè)鏈與 SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物。 ? SDS是一種強(qiáng)陰離子型去污劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 ? Poly His多聚組氨酸能與多種過渡金屬或過渡金屬鰲和物結(jié)合，因此帶 HIS6的蛋白能
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