電鏡冷凍制樣技術(shù)newb(參考版)
2025-05-04 07:53本頁(yè)面
【正文】 ？常用的冷凍保護(hù)劑及保護(hù)方法？ ？它的主要步 驟及優(yōu)缺點(diǎn)是什么？ ？如何命名？ ？ 生物電子顯微技術(shù) 大鼠肝細(xì)胞冷凍蝕刻照片 生物電子顯微技術(shù) 分離的人沙眼支原體 生物電子顯微技術(shù) 小鼠肝細(xì)胞冰凍蝕刻照片 生物電子顯微技術(shù) 洋蔥的根細(xì)胞 生物電子顯微技術(shù) 人肺 II型板層體冷凍蝕刻照片 生物電子顯微技術(shù) 冷杉木材管胞紋孔及微纖絲 。） 生物電子顯微技術(shù) ⑷ 刀溫比樣品溫度高 10～ 20℃ ⑸ 根據(jù)研究的目的選擇樣品的溫度 生物電子顯微技術(shù) 2. 切片的速度和厚度 樣品溫度 60℃ ～ 80℃ 切速： 厚度： 70～ 100nm 3. 刀的選擇 : (玻璃刀，鉆石刀 ) 注意： (1) 切片之前冷卻刀 (2) 鉆石刀反復(fù)使用后需要調(diào)整 (3) 玻璃刀口上噴鎢，增加其鋒利性 (4) 鉆石刀使用后需認(rèn)真清洗，防止腐蝕 (5) 使用玻刀時(shí)，用鋁鉑膠條做水槽，冷的 硅膠密封 生物電子顯微技術(shù) ◆切片機(jī)修塊法 ◆預(yù)修塊法 : (關(guān)鍵：穩(wěn)定溫度） ◆濕刀法：低溫下， DMSO做槽液 ◆干刀法：無(wú)槽液，刀角 50～ 70176?？梢岳鋬鲋睆綖?1mm左右的樣品，如真菌芽孢。 生物電子顯微技術(shù) (四 )、冷凍保護(hù)處理 ： 20～ 60%甘油水溶液 20～ 50%DMSO,5%聚乙烯醇 ～ ： 5min～ 3h ： 組織含水量 ↗ ，保護(hù)劑濃度 ↗ 生物電子顯微技術(shù) (五）、冷凍固定 ： 1－ 2S，達(dá)－ 196℃ 液氦－ 273 ℃ （中間冷媒法） （液態(tài)丙烷） 生物電子顯微技術(shù) ： 銅塊 → 液氮中 → 銅塊接觸樣 → 樣預(yù)冷 → 樣入液 N 雙丙烷噴氣式冷凍機(jī) RMC MF7200 高壓冷凍機(jī) Leica／ Reichert 樣品夾放入高壓腔中，注入液氮，加壓冷凍。 一般的形態(tài)學(xué)研究 ： %戊二醛固定 15－ 60min, 4℃ 做免疫電鏡標(biāo)記時(shí) ： － 1%戊二醛固定 5－ 15min,4℃ 生物電子顯微技術(shù) （三）、預(yù)包埋 (包封、夾埋 ) 包封： 采用某些大分子量的支持介質(zhì)，將組織塊包埋起來(lái)，以便于切出大面積平整的切片。 生物電子顯微技術(shù) ⑵ 固定樣品制備法 ： 步驟 ：取材 → 醛類固定 → 樣品包封（夾埋） → 冷凍保護(hù)處理 → 切片 → 染色 → 鏡檢 特點(diǎn) ：該方法用醛類固定及冷凍保護(hù)處理， 較好保存細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)， 應(yīng)用 ：適用進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫化 學(xué)的研究。 ： 生物電子顯微技術(shù) 7. 所用儀器：冷凍超薄切片機(jī) ⑴ 、儀器準(zhǔn)備： 專用的冷凍超薄切片： FC4E,FC4D 配有附件的普通超切機(jī) 如： Sweden LKB Cryo NoVa,LKB2088 ⑵ 、 FC 4E性能： a. 5min內(nèi)完成制冷，最低 t=190℃ b. 靈活調(diào)節(jié)刀、樣品的溫度 c. 液氮消耗低、自動(dòng)充盈，連續(xù) 3h d. 切片小室內(nèi)不結(jié)霜，利于操作 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 8. 冷切制備程序的分類 ⑴ 無(wú)溶液制備法 ： 步驟 ：取材 → 快速冷凍 → 切片 → 干燥 → 染色或不染色 → 鏡檢； 特點(diǎn) ：有利于保存生物材料中的可溶性物 質(zhì)及生物大分子的活性和天然構(gòu)型。 ⑵ 、切片前后避免了化學(xué)藥劑的處理，樣品結(jié)構(gòu)、成分不發(fā)生變化，尤其可溶性成分不被抽提，保持了細(xì)胞或組織的原始生活狀態(tài)，使電鏡圖像更具有接近生物的存活狀態(tài)。 投影噴鉑，厚 2－ 5nm，垂直噴碳 加固， 10－ 20nm ： 腐蝕劑：動(dòng)物： 10～ 30％ NaClO 植物：鉻酸 、打撈、干燥復(fù)型膜 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) (三 )、冷凍斷裂復(fù)型膜的命名 (Branton,1975) : E半膜（外半膜）：連接細(xì)胞外空間及 細(xì)胞內(nèi)空間 (包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、核周間隙、 線粒體內(nèi)等 )的半膜 P半膜（胞質(zhì)半膜）：連接細(xì)胞質(zhì)、核 質(zhì)、線粒體和葉綠體基質(zhì)的半膜 ： P半膜上的親水面 PS面（ protoplasmic Surface) P半膜上的疏水面 PF面（ protoplasmic f
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