電鏡冷凍制樣技術(shù)newb(完整版)
【正文】 細(xì)結(jié)構(gòu)； ⑵ 制樣簡單，不損傷樣品，圖像 具有立體感， ⑶ 在 TEM下可以觀察樣品天然表 面或人工斷面的細(xì)微結(jié)構(gòu)特征。 結(jié)冰過程： 0～－ 90℃ ： 六角型晶體 － 90℃ ～－ 140 ℃ ： 立方體 低于－ 140 ℃ ：玻璃態(tài)無定形結(jié)構(gòu)（非晶態(tài)） （三）、應(yīng)用范圍： 形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡技術(shù)、 放射自顯影、尤其 X－ ray微區(qū)分析領(lǐng)域； 其它材料的研究：塑料、橡膠、及高分子材料 （四）、冰晶損傷： 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 結(jié)冰過程與結(jié)冰速率 ① 生物樣品結(jié)冰過程： 細(xì)胞外結(jié)冰：結(jié)冰溫度較高、速率低 細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰：結(jié)冰溫度較低、速率高 ② 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 冷凍速率低時 ,冷度溫度較高，胞間形成較 大冰晶，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu) 冷凍速率很高時 ,冷度溫度很低，胞內(nèi)外同 時形成玻璃態(tài)冰，無損傷 ③ 結(jié)論 : 防止冰晶形成的關(guān)鍵 :提高冷卻速率 （ 103 ～ 104℃/ s） 、 降低冷凍溫度 生物電子顯微技術(shù) 冷凍劑（冷媒） 常用：液氮、液態(tài)丙烷、氟里昂、 液氦，液態(tài)乙烷 生物電子顯微技術(shù) 冷凍速率 ↗ 冰晶直徑 ↘ 冷凍損傷 ↘ 生物電子顯微技術(shù) 冷凍保護(hù)劑 ★ 目的：防止冰晶損傷 ★ 原理： 保護(hù)劑與水分結(jié)合，減少樣品中 的水分，從而降低樣品的冰凍點(diǎn) ★ 常用的保護(hù)劑： 甘油、二甲基亞砜（ DMSO）、 蔗糖、乙二醇 生物電子顯微技術(shù) 產(chǎn)生冰晶損傷的原因及排除方法 ▲ 原因：冷卻速率不足；樣品塊過大 ▲ 排除方法： ①選擇優(yōu)質(zhì)冷凍劑 ②使用最佳冷凍裝置 ③剁碎樣品 ④冷凍前用冷凍保護(hù)劑處理樣品 生物電子顯微技術(shù) 第二節(jié) 冷凍斷裂 (蝕刻 )和復(fù)型技術(shù) 一 技術(shù)概況 二 基本原理 三 樣品的制備 生物電子顯微技術(shù) ： ⑴ .避免化學(xué)試劑對樣品的損傷，保持細(xì)胞 原有結(jié)構(gòu)。 投影噴鉑，厚 2－ 5nm，垂直噴碳 加固， 10－ 20nm ： 腐蝕劑：動物： 10～ 30％ NaClO 植物：鉻酸 、打撈、干燥復(fù)型膜 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) (三 )、冷凍斷裂復(fù)型膜的命名 (Branton,1975) : E半膜（外半膜）：連接細(xì)胞外空間及 細(xì)胞內(nèi)空間 (包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、核周間隙、 線粒體內(nèi)等 )的半膜 P半膜（胞質(zhì)半膜）：連接細(xì)胞質(zhì)、核 質(zhì)、線粒體和葉綠體基質(zhì)的半膜 ： P半膜上的親水面 PS面（ protoplasmic Surface) P半膜上的疏水面 PF面（ protoplasmic fracture face) ES(extracellular),EF 生物電子顯微技術(shù) 生物電子顯微技術(shù) 第三節(jié) 冷凍超薄切片 一 技術(shù)概況 二 冷切的基本流程 三 冷切的總結(jié) 生物電子顯微技術(shù) ： 將樣品迅速冷凍 ,用冷凍超薄切片機(jī)進(jìn) 行切片 . : 在分子水平研究新鮮組織的超微結(jié)構(gòu) , 生物大分子和某些元素的分布組織化 學(xué)、免疫電鏡標(biāo)記 ,Xray微區(qū)分析等。 一般的形態(tài)學(xué)研究 ： %戊二醛固定 15－ 60min, 4℃ 做免疫電鏡標(biāo)記時 ： － 1%戊二醛固定 5－ 15min,4℃ 生物電子顯微技術(shù) （三）、預(yù)包埋 (包封、夾埋 ) 包封： 采用某些大分子量的支持介質(zhì)，將組織塊包埋起來，以便于切出大面積平整的切片。 ？常用的冷凍保護(hù)劑及保護(hù)方法？ ？它的主要步 驟及優(yōu)缺點(diǎn)是什么？ ？如何命名？ ？ 生物電子顯微技術(shù) 大鼠肝細(xì)胞冷凍蝕刻照片 生物電子顯微技術(shù) 分離的人沙眼支原體 生物電子顯微技術(shù) 小鼠肝細(xì)胞冰凍蝕刻照片 生物電子顯微技術(shù) 洋蔥的根細(xì)胞 生物電子顯微技術(shù) 人肺 II型板層體冷凍蝕刻照片 生物電子顯微技術(shù) 冷杉木材管胞紋孔及微纖絲 。 生物電子顯微技術(shù) (四 )、冷凍保護(hù)處理 ： 20～ 60%甘油水溶液 20～ 50%DMSO,5%聚乙烯醇 ～ ： 5min～ 3h ： 組織含水量 ↗ ，保護(hù)劑濃度 ↗
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