【正文】 用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬茉谑终粕险袂?80 次，使菌片上的細(xì)菌被洗脫進(jìn)入中和液中，再放置5min以上，使中和作。1℃ 水浴箱內(nèi) 5min 后，用無菌鑷子分別放入預(yù)先制備的菌片 3 片，并使之浸透于消毒液中。按每片 的量，吸取相應(yīng)濃度的消毒劑溶液注入平皿中。如果消毒試驗(yàn)組消毒處理后平均生產(chǎn)菌落數(shù)，小于等于1時，其殺滅對數(shù)值，即大于等于試驗(yàn)前對照組平均活菌濃度的對數(shù)值。（7）所有試驗(yàn)樣本均在 37℃ 溫箱中培養(yǎng)，對細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h 觀察最終結(jié)果；對細(xì)菌芽孢需培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。如平板上生長的菌落數(shù)較多時，可進(jìn)行系列10倍稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（4）待試驗(yàn)菌與消毒劑相互作用至各預(yù)定時間， 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。（3）取消毒試驗(yàn)用無菌大試管，混勻，置 20℃177。1℃ 水浴備用。 懸液定量殺菌試驗(yàn)操作程序（1）首先按產(chǎn)品說明書要求配制消毒液。根據(jù)各種試驗(yàn)的規(guī)定，用稀釋液代替消毒劑溶液，按上述同樣的步驟進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)所試菌種和消毒劑對該菌的殺滅能力，選定一株抗力較強(qiáng)的菌和一個消毒劑濃度（即產(chǎn)品使用說明書中指定的最低濃度）以及一個作用時間（說明書指定最短作用時間）進(jìn)行試驗(yàn)。如說明書指定最短作用時間為20min，則應(yīng)進(jìn)行10min、20min、30min 三個時間）進(jìn)行試驗(yàn)。第一種適用于消毒產(chǎn)品鑒定。 試驗(yàn)分組試驗(yàn)中應(yīng)分以下各組：（1）試驗(yàn)組。（11）電動混合器。（9）恒溫水浴箱。（7）含中和劑的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（中和劑TSB），中和劑經(jīng)鑒定合格。懸液試驗(yàn)用3%BSA溶液，載體試驗(yàn)直接用TSB(見附錄A)。（4）消毒劑稀釋用硬水：見附錄A。各組消毒劑溶液有效成份濃度的計(jì)算，應(yīng)以試驗(yàn)菌與消毒劑的混合液中有效成份的最終濃度為準(zhǔn)。消毒劑溶液濃度應(yīng)以所含有效成份為準(zhǔn)。此外，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要，準(zhǔn)備其他菌種的懸液或菌片。 細(xì)菌定量殺滅試驗(yàn) 目 的 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測定消毒劑殺滅懸液中或載體上細(xì)菌繁殖體和細(xì)菌芽孢所需劑量，以驗(yàn)證實(shí)用消毒劑量。5）本規(guī)范推薦使用過濾沖洗法。3） 第 4 （組）測定的結(jié)果，微生物數(shù)量應(yīng)在 1107 cfu/ml～5107 cfu/ml 之間，其組間差不得超過兩組回收菌數(shù)平均值的50%。2） 第 2 組有遠(yuǎn)較第 1 組為多，但較第 4（組）為少的試驗(yàn)菌生長。吸取試驗(yàn)菌懸液 ，置含 ml 稀釋液的試管中，不加消毒劑，亦不作任何去除處理，進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，作為陽性對照值。取最終樣液 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋，選擇 2個～3個適宜稀釋度懸液，各取 ，分別接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可先進(jìn)行10 倍系列稀釋，再經(jīng)過濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。3） 第 3 組。作用至試驗(yàn)預(yù)定時間，對其進(jìn)行去除消毒劑處理，并取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)（如為濾膜法，可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面）。混勻后，置20℃177。吸取最終樣液 接種于平皿內(nèi)，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃中水浴）于試管內(nèi)，混勻，作用至試驗(yàn)預(yù)定時間?；靹蚝?，置20℃177。4）菌懸液 → 培養(yǎng) 作為菌懸液陽性對照值。2）（菌懸液 + 消毒劑） + 過濾沖洗法處理 → 培養(yǎng)觀察所用去除消毒劑處理后，受到消毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長。通常，懸液鑒定試驗(yàn)結(jié)果可用于載體試驗(yàn)。當(dāng)用其他特定微生物 （如龜分枝桿菌膿腫亞種） 進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時，均應(yīng)以該特定微生物再次進(jìn)行去除消毒劑方法的鑒定試驗(yàn)。（4）同一消毒劑擬對多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時，所用物理去除消毒劑法應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，不得互相取代。此時可增加處理時間或次數(shù)，亦可適當(dāng)縮短作用時間再試。濃度過低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則（1）通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定所選方法是否對測試消毒劑有良好的去除作用，對試驗(yàn)用微生物以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。常用的有：水、緩沖液（如PBS）、稀釋液、%～%吐溫80的PBS、中和劑（可中和部分消毒成分）。（4）無菌稀釋液、沖洗液。（2）離心沉淀法需用離心機(jī)與離心管。 物理法去除殘留消毒劑試驗(yàn) 目 的 通過本鑒定試驗(yàn)，確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑，使消毒劑鑒定試驗(yàn)顯示出真正的殺菌效果。（3）在計(jì)算微生物濃度時，須考慮其稀釋倍數(shù)。 注意事項(xiàng)（1）試驗(yàn)所分各組均有其特定意義，不得任意刪減。否則，說明試劑有污染，應(yīng)更換無污染的試劑重新進(jìn)行試驗(yàn)。第5 組間菌落數(shù)誤差率計(jì)算公式其計(jì)算公式如下。（3） 第 5（組）有相似量試驗(yàn)菌生長，懸液試驗(yàn)在1107 cfu/ml～5107 cfu/ml之間，載體試驗(yàn)在 5105 cfu/片～5106 cfu/片 之間。（2） 第 2 組有較第 1 組為多，但較第 5（組）為少的試驗(yàn)菌菌落生長，并符合表 21 要求者。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基15ml～20ml，培養(yǎng)觀察。用稀釋液 做10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后， 用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于稀釋液中。（5）第 5 組。作用 10min，用無菌鑷子取出菌片，移入含 中和產(chǎn)物溶液的試管中，用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。 吸取中和產(chǎn)物溶液 （以一片浸有消毒劑的載體置 中和劑內(nèi)，作用10min） 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。吸取該最終樣液 ，用中和劑做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和劑內(nèi)，作用 10min。（3）第 3 組。作用10min，分別接種于各平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。吸取消毒劑 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃177。用電動混合器混合20s，或?qū)⒃嚬苷翊?0次，吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃水浴中5min后，用無菌鑷子夾入一菌片，并使浸透于消毒液中。（1）第1組。 中和劑載體定量鑒定試驗(yàn)操作程序根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號。如出現(xiàn)細(xì)菌生長，可能提示試驗(yàn)材料或操作過程中有污染。（6）第 6 組。1℃ 水浴中5min 后，混勻。（5）第5組。1℃ 水浴中 5min 后，（，作用 10min 配制而成）于試管內(nèi)，混勻。（4）第 4 組。作用10min。置 20℃177。如平板生長菌落數(shù)均超過 300 個，應(yīng)以稀釋液對上述最終樣液作適宜稀釋后，再次進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。作用至預(yù)定時間，吸此樣液 加于含 中和劑溶液管中，混勻，作用10min。置 20℃177。接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后，混勻。（1）第 1 組。制成含有機(jī)干擾物質(zhì)的菌懸液，置20℃177。1℃水浴中待用。 中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序 根據(jù)試驗(yàn)分組，準(zhǔn)備足量試管和平皿，依次進(jìn)行編號。第5組 稀釋液 + 菌懸液 → 培養(yǎng)作為菌數(shù)對照。第3組 中和劑 + 菌懸液 → 培養(yǎng)觀察中和劑是否抑菌。 試驗(yàn)分組第1組 消毒劑 + 菌懸液 →培養(yǎng)觀察消毒劑對試驗(yàn)菌有無殺滅或抑制能力。當(dāng)3組平板上長出的菌落數(shù)接近，如果以陽性對照組為標(biāo)準(zhǔn)（X），前兩組長菌數(shù)為（X177。（3）試驗(yàn)同時設(shè)陽性對照組。初選操作程序如下：（1） 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～3103 cfu/ml）加入含 中和劑試管中，混勻，作用30min后，用TSA傾注法培養(yǎng)。（6）鑒定時根據(jù)所用殺菌試驗(yàn)方法，使用相應(yīng)的懸液或載體定量試驗(yàn)。對細(xì)菌繁殖體，在大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）中任選其一進(jìn)行試驗(yàn)即可；對細(xì)菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種（ATCC 9372）芽孢進(jìn)行。若縮短作用時間后仍無菌生長，在排除其他原因的基礎(chǔ)上，可適當(dāng)下調(diào)殺菌試驗(yàn)中消毒劑濃度，再次進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。細(xì)菌是否復(fù)蘇。濃度過低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。（2）在確定用何種中和劑進(jìn)行鑒定試驗(yàn)有困難時，可對多個中和劑進(jìn)行初選以確定（見本款文后【附】）。（6）胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：見附錄A。（4）恒溫水浴箱。（2）刻度吸管（、）。 中和劑鑒定試驗(yàn) 目 的確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)菌和真菌殺滅試驗(yàn)。故每進(jìn)行一種消毒試驗(yàn)（包括消毒劑或微生物的更換），均需按規(guī)定對所選方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，合格者方可用于正式試驗(yàn)。（3）為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所用吸管的容量應(yīng)盡量與擬吸取的液體量相近，不要用大吸管吸取少量液體；試驗(yàn)樣本的混勻操作，必須認(rèn)真進(jìn)行；盡量減少中和劑或中和產(chǎn)物與試驗(yàn)微生物的接觸時間。（2）每次吸液，均須更換一支無菌吸管，以防交叉污染。操作要點(diǎn)：①對接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時間后，即時以對微生物無害的稀釋液稀釋，稀釋比例隨試驗(yàn)需要決定；②電動混合或敲打振蕩，使之混勻；③吸取稀釋樣液進(jìn)行隨后培養(yǎng)檢測。單獨(dú)使用時，一般多用于濃度系數(shù)較高的消毒劑（如醇類消毒劑）。但若稀釋過多，微生物濃度下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。操作要點(diǎn)：①準(zhǔn)備好裝有相應(yīng)孔徑微孔濾膜的濾器；②濾膜及濾器需先經(jīng)滅菌處理；③初次過濾后，應(yīng)使用一定量對微生物無害的稀釋液進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)一般以洗凈消毒劑為準(zhǔn)；④最后一次沖洗、濾凈后，將微孔濾膜以無菌操作法取出，進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗(yàn)中，如以植物提取物制備的消毒劑。操作要點(diǎn)：①對接觸消毒劑的微生物樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中；②所用中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗(yàn)結(jié)果規(guī)定的相同；③即刻混勻，并按規(guī)定時間吸取樣液進(jìn)行隨后的培養(yǎng)檢測；④在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時間內(nèi)進(jìn)行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過久。對常用消毒劑，雖有一些中和劑介紹，但在實(shí)際應(yīng)用中由于情況多變，效果不一定都理想。 除藥的方法（1）化學(xué)中和法：又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達(dá)規(guī)定時間的終點(diǎn)時，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續(xù)抑制或殺滅微生物的方法。（3）不破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份，不影響其透明度。 除藥的原則（1）可有效去除殘留的消毒劑。因?yàn)橄倔w系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用，從而可導(dǎo)致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產(chǎn)生假陰性結(jié)果。（9）結(jié)果計(jì)算時，必須弄清稀釋倍數(shù)，以免計(jì)算錯誤。勿使培養(yǎng)基外溢，以免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和造成環(huán)境的污染。（7）傾注時瓊脂培養(yǎng)基溫度不得超過45℃，以防損傷細(xì)菌或真菌。（5）每吸取一個稀釋度樣液，必須更換一支吸管，以減少誤差。（3）注意菌液的均勻分散。（1）平板間誤差率計(jì)算公式：（2）稀釋度間誤差率計(jì)算公式： 注意事項(xiàng)（1）嚴(yán)格無菌操作，防止污染。 活菌計(jì)數(shù)中技術(shù)操作誤差的測定試驗(yàn)者在活菌計(jì)數(shù)中因技術(shù)操作而引起的菌落數(shù)誤差率（平板間、稀釋度間）不宜超過10%。將求得的平均菌落值，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升原樣液中的菌量。但對黑曲霉菌活菌計(jì)數(shù)及殺滅試驗(yàn)時，平板菌落數(shù)應(yīng)在15cfu～100cfu之間。（10）計(jì)數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。培養(yǎng)至規(guī)定時間（細(xì)菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為 72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底向上，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。（6）將冷至40℃～45℃的熔化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿15ml～20ml。一般需接種2個～3個不同稀釋度。（5）選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長菌落數(shù)每平板為 15cfu～300cfu 者為宜），吸取其中混合均勻的懸液 加于無菌平皿內(nèi)。如此類推，直至最后一管。（3）將菌懸液樣本在用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80次），隨即吸取 101 管內(nèi)。（2）將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 稀釋液。而后，用電動混合器混合20s（或在手掌上用力振敲 80 次），將菌洗下形成菌懸液。洗菌時，一般以稀釋液為洗液。（1）對菌懸液可直接進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。（4）電動混合器 操作程序本規(guī)范要求在殺菌試驗(yàn)中的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)一使用傾注法。（2）稀釋液：見附錄A。 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù) 適用范圍測定細(xì)菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數(shù)量。（5）用帶橡皮塞的容器保存菌液時，應(yīng)將其預(yù)先煮沸10min 進(jìn)行脫硫處理。此時，應(yīng)提高初始菌濃度，以便達(dá)到所需的菌量。（2）滴染時，菌液滴加量不宜過多，避免流散影響染菌的準(zhǔn)確性。 注意事項(xiàng)（1）用濁度計(jì)測定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時對菌懸液稀釋度的估計(jì)。滴染菌液后，染菌載體可置37℃溫箱內(nèi)干燥（約20min～30min），或置室溫下自然陰干后再使用。菌液滴加量每片為10μl。含菌量約為1108cfu/ml～5108cfu/ml，可使用濁度計(jì)調(diào)整菌液濃度。染菌用菌懸液：使用TSB營養(yǎng)肉湯配制。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾紙制作。在剪開前，先將脫脂的布塊按載體規(guī)定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。脫脂方法如下：①將載體放在含洗滌劑的水中煮沸30 min；②以自來水洗凈；③用蒸餾水煮沸 10min；④用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；⑤晾干、熨平備用。 當(dāng)以金屬片為載體時，因方形金屬載體在振敲時可將玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 ）。根據(jù)其特點(diǎn)選擇適宜材料載體作為代表。 菌片的制備程序（1）消毒試驗(yàn)中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。10）芽孢懸液在使用時，應(yīng)先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。待冷至室溫后，保存于4℃冰箱中備用。8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶內(nèi)蒸餾水中，并加入適量小玻璃珠。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。6）用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液，清除其中的瓊脂凝塊。將第一和第二批洗下的菌懸液集中