【正文】 表 21 中和劑鑒定試驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)中對第 1 組與第 2 組菌落數(shù)的要求 第 1 組平板平均菌落數(shù) 第 2 組平板平均菌落數(shù) 0 5 X（ 1～ 10） （ X + 5） Y（ 10） （ Y + Y） 注：對抑菌作用不明顯消毒劑（如乙醇）所用中和劑的鑒定試驗(yàn)中，當(dāng)?shù)? 1 組與第 2 組菌落數(shù)相近，難以達(dá)到本表要求時，可根據(jù)具體情況另行作出判斷和評價(jià)。 評價(jià)規(guī)定 試驗(yàn)結(jié)果符合以下全部條件，所測中和劑可判為合格 : （ 1） 第 1 組無試驗(yàn)菌，或僅有極少數(shù)試驗(yàn)菌菌落生長。如出現(xiàn)細(xì)菌生長，提示試驗(yàn)材料或操作過程中可能有污染。 （ 6）第 6 組。作用 10min，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 稀釋液的試管中，用電動混合器混合 20s， 或?qū)⒃嚬苷翊? 80 次，混勻。吸取稀釋液 于無菌小平皿內(nèi)，將其置 20℃ 177。吸取該最終樣液 ， — 24— 用中和產(chǎn)物溶液做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入 1 菌片，并使浸透于中和產(chǎn)物溶液中。 （ 4）第 4 組。立即用無菌鑷子取出菌片移入含 ml 中和劑試管中，用電動混合器混合 20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次，混勻。吸取中和劑 于無菌小平皿中，將其置 20℃ 177。 如平板生長菌落數(shù)均超過 300個， 應(yīng)重新吸取該最終樣液 ，用稀釋液做適當(dāng)稀釋，選適宜稀釋度懸液，吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后，用無菌鑷子夾入一菌 片，并使浸透于消毒液中，待作用至試驗(yàn)預(yù)定時間，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 中和劑試管中，用電動混合器混合 20s，或?qū)⒃嚬苷翊?80 次。 （ 2）第 2 組。待作用至試驗(yàn)預(yù)定的時間，立即用無菌鑷子取出菌片移入含 試管中，作用 10min。吸取消毒劑 ，將其置 20℃ 177。各組分 別用適宜大小容量的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗(yàn)樣本。應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。分別吸取稀釋液 、 中和劑 和硬水 各 ，倒入上述試驗(yàn)同批次的培養(yǎng)基 25ml，培養(yǎng)觀察。 加入 ， 作用 10min ，用 稀釋液 做 10倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。吸取 ， 置 20℃ 177。作用 10min，吸取該最終樣液 ，用中和產(chǎn)物溶液做 10 倍系列稀釋，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。吸取 ， 置 20℃ 177。用中和劑 做 10倍系列稀釋 ，選適宜稀釋度懸液，各吸取 ，分別接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后， 加入 ，混勻。 （ 3）第 3 組。吸取該最終樣液 ，接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。1℃ 水浴中 5min 后， 再吸加 ，混勻。 （ 2）第 2組。作用至預(yù)定時間，吸此樣液 加于含有 稀釋液的 試管中，混勻。吸取 ， 置 20℃ 177。 1℃水浴中備用。 按 。 將消毒劑按所需濃度配制好后，置 20℃177。 第 6組 稀釋液 + 中和劑 + 培養(yǎng)基 → 培養(yǎng) 作為陰性對照。 第 4組 （消毒劑 + 中和劑） + 菌液 → 培養(yǎng) 觀察中和產(chǎn)物，或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗(yàn)菌的生長繁殖是否有影響。 第 2組 （消毒劑 + 菌懸液） + 中和劑 → 培養(yǎng) 觀察殘留消毒劑被 中和后受到清毒劑作用后的試驗(yàn)菌是否能恢復(fù)生長。50%X）以內(nèi)，可 進(jìn)行正式的 鑒定試驗(yàn)。陽性對照組以 菌懸液加入含 稀釋液試管中，混勻，作用 30min后，取 ，用 TSA傾注法培養(yǎng)。 （ 2）將 試驗(yàn)菌懸液（含菌量為 1103 cfu/ml～ 3103 cfu/ml）加入含 物試管中，混勻，作用 30min后，取 ，用 TSA傾注法培養(yǎng)。 【附】中和劑初選試驗(yàn) 中和劑鑒定試驗(yàn)前，若難確定擬檢測的中和劑，可通過本試驗(yàn)初選，而后以選中的中和劑進(jìn)行正式的鑒定試驗(yàn)。 當(dāng)用其他特定微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時，均應(yīng)以該特定微生物進(jìn)行中和劑的鑒定試驗(yàn)。 （ 5）同一消毒劑擬對多種微生物進(jìn)行殺滅試驗(yàn)時，應(yīng)按微生物種類分別進(jìn)行鑒定試驗(yàn) 。此時可適當(dāng)縮短作用時間 重新進(jìn)行試驗(yàn) ，但作用時間最短不得少于 30s，否則難以控制試 驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 （ 4）鑒定試驗(yàn)中，消毒后去除殘留消毒 劑 組（第 2組）無菌生長，不能表明中和后 受到消毒劑作用后的細(xì)菌是否能恢復(fù)生長。 （ 3）試驗(yàn)中所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中使用的最高濃度為準(zhǔn)。 （ 7）電動混合器 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則 （ 1）通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，應(yīng)可確定 所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗(yàn)用細(xì)菌以及其恢復(fù)期培養(yǎng)是否有害或不良影響。 （ 5） 稀釋液 ：見附錄 A。 （ 3）小平皿（ 4 cm～ 6cm 直徑）。 試驗(yàn)器材 （ 1）試驗(yàn)菌菌懸液和菌片（見 ）。此步驟絕不可省略 ，否則極有可能導(dǎo)致試驗(yàn)產(chǎn)生錯誤結(jié)果。 （ 4）所用方法適宜與否，和消毒劑性質(zhì)、復(fù)方中的附加成份、試驗(yàn)微生物種類、消毒試驗(yàn)種類等等均有關(guān)系，試驗(yàn)條件稍有改變就可能影響除藥效果。此點(diǎn)由于操作繁瑣，器材需求量大，往往不能認(rèn)真執(zhí)行，應(yīng)加以注意。 注意事項(xiàng) （ 1）處理時應(yīng)嚴(yán)守?zé)o菌操作要求，所有試液須無菌，接觸樣本和試液的器材（如吸管、平皿、試管、濾材等）亦均須經(jīng)滅菌，以免污染樣本，影響試驗(yàn)結(jié)果。本法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。本法可單獨(dú)使用，但更常見的是與其它方法同 時使用。 （ 3）稀釋法 將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，用稀釋液稀釋，降低殘留消毒劑濃度，以消除對微生物的抑制作用。本除藥方法應(yīng)按擬進(jìn)行試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。 （ 2）過濾沖洗法 將經(jīng)消毒劑作用過的微生物樣本，立即加入適量稀釋液中混勻（通過適量稀釋，可減輕消毒劑的持續(xù)作用），并傾入裝有微孔濾膜的濾器內(nèi)，接真空泵抽吸過濾（或加壓過濾）后，再加適量稀釋液沖洗，同時過濾，可去除殘留的消毒劑。所以，在消毒試驗(yàn)前仍應(yīng)將擬用中和劑按試驗(yàn)具體情況，經(jīng)鑒定合格后再使用。本法同時含有稀釋作用效果（至少 1:1稀釋，常用 1:10稀釋） ， 是最為普遍使用的方法。 （ 4）必須按規(guī)定方法進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，并認(rèn)為合格者 方可在相應(yīng)的消毒試驗(yàn)中使用。 （ 2）對微生物無害，不減少微生物應(yīng)有的回收量。殘留消毒劑的去除（下簡稱除藥），可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗(yàn)獲得正確結(jié)果。 殘留消毒劑的去除方法 目 的 在化學(xué)消毒試驗(yàn)中，達(dá)到規(guī)定消毒時間 終點(diǎn)時，要求立即終止殘留消毒劑的繼續(xù)作用，以便準(zhǔn)確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數(shù)量。 （ 8）為提高試驗(yàn)成功率，最好先用濁度計(jì)對原菌液含菌量做出估計(jì)，盡可能在首次試驗(yàn)時所取的有限稀釋范圍內(nèi)（ 2個 ～ 3個 稀釋度）即有長菌在 15cfu～ 300cfu 之 間的平板。傾注和搖動時，動作應(yīng)盡量平穩(wěn)，以利細(xì)菌分散均勻，便于計(jì)數(shù)菌落。 （ 6）樣液接種于平皿后應(yīng)盡快傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，避免樣液干燥于平皿上，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （ 4）稀釋或取液時要準(zhǔn)確，盡量減少吸管使用中產(chǎn)生的誤差。 （ 2）認(rèn)真檢查試驗(yàn)器材有無破損（要特別注意試管底的裂痕和破洞），以防丟失樣本和污染環(huán)境。對誤差率的自檢，可按以下公式計(jì)算。菌量單位為 cfu。 對估計(jì)菌量極少的樣本（如消毒處理后樣本），在培養(yǎng)計(jì)數(shù)時可不作稀釋，即使平板菌落數(shù)未達(dá) 15時，亦可用其計(jì)算最終結(jié)果。以菌落數(shù)在 15cfu～ 300cfu的平板為準(zhǔn)，每個稀釋度 3 個平板生長菌落數(shù)全合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該 3個平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有 2個符合上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的兩個平板菌落的平均值為結(jié)果。 （ 9）對菌片和采樣棉拭 洗液的活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，先按各試驗(yàn)要求處理（如去除殘留消毒劑等），而后取其最終樣液按上法進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。 （ 8）每日觀察細(xì)菌生長情況。 （ 7）將平皿蓋好，即刻輕輕搖動混勻，平放于臺上。平皿加樣前，應(yīng)先按組編號，以免弄混。每一稀釋度接種 3個平皿。必要時，還可作某稀釋度的 1:1或 1:4稀釋。 （ 4）將 101 管依前法用電動混合器混合 20s（或在手掌上用力振敲 80次），混勻，再吸取出 102 管內(nèi)。各組由左向右，逐管標(biāo)上 10 10 103......等。以上操作應(yīng)嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。具體方法如下 : 取含 稀釋液無菌試管，對菌片或小型固體樣本直接投入即可，對棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等，應(yīng)將其上的細(xì)菌洗下成為菌懸液后進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。其操作程序如下。 （ 3）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ： 見附錄 A。 試驗(yàn)器材 （ 1）刻度吸管（ 、 ）。 （ 6）制得的菌懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時放入冰箱內(nèi)，盡量減少在室溫下放置時間，以 減少 細(xì)菌的自然死亡。 （ 4）配制 菌懸液和制備菌片時，嚴(yán)格按無菌要求操作，以防污染雜菌，影響隨后殺菌試驗(yàn)的結(jié)果。 （ 3） 細(xì)菌繁殖體在烤干過程中，可引起部分死亡，如銅綠假單胞菌在 37℃ 干 燥 過程中，滴度最高可下降 1個對數(shù)值。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報(bào)告（如殺菌試驗(yàn)中陽性對照組菌懸液或菌片所含菌量），必須以活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)的實(shí)測結(jié)果為準(zhǔn)，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計(jì)值。 （ 5）每個菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為 5105 cfu/片～ 5106 cfu/片。用 10μl移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個載體表面。 滴染法染菌時，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無菌平皿內(nèi)，逐片滴加菌液。細(xì)菌繁殖體，可直接使用經(jīng) 18h～ 24h培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物，細(xì)菌芽孢可使用 4℃ 冰箱貯存液。 （ 4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法 染菌 。此法制成的載體大小一致，且無毛邊。 （ 3）布片用白平紋棉布制作。 （ 2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。載體可以為方形，大小為 10mm10mm。載體應(yīng)根據(jù)消毒對象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、 棉 布等。 11）懷疑有雜菌污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。 有效使用期為半年。 9）將芽孢液放于 80℃ 水浴中 10min（或 60℃ ， 30min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。再離心和重新懸浮清洗，先后共 3遍。 7）將過濾后的芽孢懸液，置無菌離心管內(nèi)，以 3000 r/min 速度離心 30min。 5）必要時，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽孢。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內(nèi)吸加 無菌蒸餾水，重復(fù)洗菌一遍。芽孢呈綠色，菌體呈紅色。 ③ 加 % 沙黃水溶液，染 1min。將平皿蓋好，放 54℃ ～ 56℃ 條件下，加熱 30min。而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。否則， 應(yīng)繼續(xù) 在室溫下放置一定時間，直至達(dá)到上述芽孢形成率后再進(jìn)行以下處理。 3）用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在顯微鏡（油鏡）下進(jìn)行鏡檢。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h，即為第 3 代培養(yǎng)物。取含 5 ml～ 10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h。 5）懷疑有污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。 4）細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在 4℃ 冰箱內(nèi)備用。隨后，用 移至另一無菌試管中，用電動混合器混合 （振蕩） 20s，或在手掌上振敲 80次，以使細(xì)菌懸浮均勻。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h，即為第 3代培養(yǎng)物。取含 ml～ 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃ 培養(yǎng) 18h～ 24h。 （ 14）電動混合器 （ 15）濁度計(jì)。 （ 12）數(shù)字可調(diào)移液器（ 10μl， 20μl， 100μl， 200μl， 1000μl）及配套用一次性塑料吸頭。 （ 10）玻璃漏斗。 （ 8）芽孢染色液：見附錄 A。 （ 6）細(xì)菌培養(yǎng)基 ： 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（ TSA），胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（ TSB）等， 見附錄 A。 （ 4）無菌蒸餾水。 （ 2）有機(jī)干擾物：見附錄 A。 試驗(yàn)器材 （ 1）菌種 :金黃色葡萄球菌 ATCC 653銅 綠 假單胞 菌 ATCC 1544 大腸桿菌 809 枯草桿菌黑色變種 ATCC 937 龜 分枝 桿菌膿腫亞種 ATCC 9332 白色葡萄球菌 803 白色念珠菌 ATCC1023黑曲霉菌 ATCC16404。不能反映消毒劑的全面特性。 — 16— 消毒 產(chǎn)品消毒效果檢 驗(yàn)技術(shù) 規(guī)范 消毒劑殺微生物試驗(yàn) 適用范圍 主要適用于消毒劑鑒定和日常監(jiān)測，用來評價(jià)各種用途的消 毒劑對微生物的殺滅效果。 7)清點(diǎn)所消耗的藥品器材，加以整修、補(bǔ)充。嚴(yán)格區(qū)分已消毒和未消毒的物品，勿使已消毒的物品被再次污染。 — 15— 5)消毒應(yīng)有條不紊，突出重點(diǎn)。要注意自我保護(hù)，既要防 止或減少受到消毒因子的傷害又要避免受到微生物感染。在用化學(xué)法消毒時應(yīng)盡量選擇對相應(yīng)致病微生物殺滅作用良好，對人、畜安全，對物品損害輕微，對環(huán)境影響小