單克隆抗體技術(shù)ppt課件(參考版)
2025-02-25 00:15本頁面
【正文】 。 噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性。可規(guī)?；a(chǎn) 。 抗體基因篩選的范圍廣 。 篩選到的噬菌體再將基因 g3或 g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 該項技術(shù)的優(yōu)點 : 將 抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系 起來 。 噬菌體表面展示系統(tǒng) (phage surface display system ) 噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點 : 外源基因表達多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白 N端 將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游 隨機克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫 從免疫或未被免疫的 B細胞中 PCR擴增抗體全套基因片段 用固相化抗原經(jīng) “ 親和結(jié)合一洗脫一擴增 ” 數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達特異性好、親和力強的抗體噬菌體庫。 噬菌體抗體庫技術(shù) 1990年 Mc Cafferty等成功地建立了 噬菌體表面展示系統(tǒng) ，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于 fd噬菌體基因 3的下游，使 ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達 106倍。 它是在 PCR技術(shù)和 Phage Display的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。 噬菌體表面展示文庫技術(shù)。 PCR技術(shù) 。 所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比 ,除了能 特異性識別腫瘤細胞 外 ,還能 將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細胞再導(dǎo)向至腫瘤細胞處 ,從而使效應(yīng)細胞的抗腫瘤活性增強 ,發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用 ,這是腫瘤治療的新突破。同樣地 ,將 VHA與 VLB連接 ,將兩組嵌合基因 置于雙順反子的表達質(zhì)粒中 ,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達質(zhì)粒 ,目前報道的表達質(zhì)粒均為雙順反子。 即能 結(jié)合靶腫瘤細胞 又能 結(jié)合高細胞毒性的效應(yīng)細胞 ,將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍 ,而且可以模擬天然配體的作用 ,與細胞表面引發(fā)分子結(jié)合 ,激活效應(yīng)細胞 ,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。 1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。 (3)單域抗體 VH 約為完整分子的 1/801/70大小，一般由一個 CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱 單域抗體。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。產(chǎn)量高，可達細菌蛋白總量的 5%20%，但需進行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性 。 如果從雜交瘤細胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用 PCR方法 擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當?shù)谋磉_載體上。 單鏈抗體 的構(gòu)建在已知親本 DNA序列時可用完全人工合成法 。 連接肽 的長度在 1015個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。 (2)Fv 或 ScFv Fv ScFv 連接肽 Fv由 VH與 VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。 把 Fab與細菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。 不含 Fc，沒有 Fc帶來的效應(yīng) 。 小分子抗體有很多優(yōu)點 : 可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低 。 研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進行 CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括 對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列 進行操作。合成所有 DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進一步即可用于構(gòu)建和表達改形抗體。（美國正式上市的 11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體） 人源化抗體的構(gòu)建可用 全合成法 或 定點突變法 。 CDR移植即把鼠抗體的 CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱 CDR移植抗體或 改型抗體 ，也就是 人源化抗體。 2 鼠單抗可變區(qū)的人源化 盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應(yīng)。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。 構(gòu)建重組表達載體 克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從 基因組文庫 中分離，也可用 PCR技術(shù) 分離。 基因工程抗體 1 人一鼠嵌合抗體 (Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。
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