單克隆抗體ppt課件(參考版)
2025-05-09 13:10本頁面
【正文】 而且隨著研究的不斷深入和發(fā)展，抗體的多樣性，親和力也大有提高。它最先被用于抗體基因文庫的構建和篩選。實驗表明，在gp gp gp9中插入外源蛋白，都會影響其構成外殼蛋白的功能，而在 gp8和 gp3的 N端插入外源蛋白后，形成的融合蛋白既可在噬菌體表面呈現(xiàn)，也不影響噬菌體的完整性和穩(wěn)定性。這種表達的融合蛋白仍保留抗原特異性和生物活性，可通過相應抗原進行檢測。 鼠 人嵌合抗體并不能徹底清除鼠源免疫原性，于是進一步提出重構抗體的設想。 基因工程單抗 ? 人 鼠嵌合抗體： 其原理是取某一 Mab基因的 V區(qū)，與人Ig基因的 C區(qū)連接，然后插入到表達質粒中，傳染骨髓瘤細胞即產(chǎn)生出鼠 人嵌合抗體。 ? 人源化單抗的制備思路： ? 人鼠雜交瘤：人脾細胞 +鼠骨髓瘤 ? 人人雜交瘤：人脾細胞 +人骨髓瘤 ? 免疫缺陷小鼠： T、 B細胞均缺乏，易植入人免疫干細胞 ? 基因工程單抗 基因工程單抗 ? 單鏈抗體 ? 用一編碼親水易折疊多肽的人工合成寡核苷酸，將重鏈 V區(qū)（ 3ˊ ）與輕鏈 V區(qū)（ 5ˊ ）端連接在一起（ VHlinkerVL）即成單鏈抗體基因，將此基因克隆入原核或真核表達載體中，在原核或真核系統(tǒng)中表達出的蛋白質即為單鏈抗體（ single chain antibodies）。 ? （ 5）基因工程與細胞培養(yǎng)技術結合的技術研究。 ? （ 3） 開發(fā)細胞生長性能優(yōu)良、細胞解解離容容易，并能重復使用的新型廉價的微載體。 ? 今后應重點開展的工作 ? （ 1） 細胞培養(yǎng)過程代謝和產(chǎn)物形成機制等方面的理論研究。 ? （ 4） 目前對細胞代謝和生長動力學的研究比較欠缺。 ? （ 3） 動物細胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)藥物存在問題與發(fā)展方向 ? （ 1）細胞密度低，產(chǎn)物濃度低。 ? C、 優(yōu)球蛋白沉淀法 該法適用于 IgG3和 IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對 IgG3單抗的回收率高于 90%，對 IgM單抗的回收率為 4090%不等。 （ 2） 單抗的粗提 ? A、 硫酸銨沉淀法 ? a. 飽和硫酸銨溶液的配制 ? b. 鹽析： ? c. 脫鹽： ? 蛋白質含量的測定： ? 分裝凍存?zhèn)溆谩? ? ：用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用 10000g 15分鐘高速離心（ 4℃ ）除去細胞殘渣及小顆粒物質。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。 ? （ 3）生物反應器培養(yǎng)雜交瘤細胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗 ? 雜交瘤細胞 ? 生物反應器 ? 培養(yǎng)液 ? 離心除去細胞，收集上清液提取抗體。也可 用注射器抽取腹水，可反復收集數(shù)次。 ? 采血量有限。 ? 細胞凍存 ? 細胞復蘇 ? （ 1）實體瘤法 ? 對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按 1～ 3 107 cells／ ml 接種于小鼠背部皮下，每處注射 。采集腹水后還應該用淋巴細胞分離液將雜交瘤細胞分離出來再凍存一部分。 ? f. 吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。 ? d. 取雜交瘤細胞懸液 1ml，加入 1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。 ? b. 臨用前將 %瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的 HT培養(yǎng)液混勻，配成 1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃ 水浴中溫育。 ? f. 取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存。 ? d. 每種雜交瘤細胞分裝 96孔板一塊，每個稀釋度 32孔，每孔量為 ，每孔的雜交瘤細胞數(shù)分別為 、 3和 10。 ? b. 制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含 20%血清的 HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含 、 15和 50個細胞3中不同的稀釋度。 ? （ 1）有限稀釋法 a. 制備小鼠腹腔細胞。 培養(yǎng)板每孔預先加飼養(yǎng)細胞。 ? 包被和溫育在濕盒內(nèi)進行。 預期結果 ? 陽性：顯色為黃色 ? 陰性：無色 1 2 3 4 陰性 陰性 陽性 陽性 注意事項 ? 洗滌徹底，避免交叉污染。 酶聯(lián)免疫吸附試驗 (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 原理 （以間接性 ELISA為例） ： 顯色 ? 酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA） ? EILSA主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體的表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成的酶結合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。
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