酶免疫分析技術(shù)ppt課件(參考版)
2025-01-23 00:30本頁面
【正文】 返回章目錄 第七章 酶免疫分析技術(shù) THANK YOU FOR YOUR ATTENTION! 返回總目錄 。隨著相關(guān)新技術(shù)的不斷問世，如雜交瘤單克隆抗體、生物素一親和素放大系統(tǒng)的應(yīng)用以及與化學發(fā)光和電化學發(fā)光技術(shù)的偶聯(lián)等，明顯地提高了分析和測定方法的特異性、靈敏度及其自動化程度，使酶免疫分析技術(shù)不斷更新，應(yīng)用范圍不斷拓寬。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 最常用的技術(shù)是以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA） ,其原理可分為夾心法、競爭法、間接法和捕獲法等。 3． ABCELISA 第七章 酶免疫分析技術(shù) 返回章目錄 ABCELISA 第七章 酶免疫分析技術(shù) 小 結(jié) 酶免疫分析技術(shù) 是以酶標記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過酶對底物的催化作用提高反應(yīng)的敏感性。當其與生物素化抗體 (直接 ABCELISA)或生物素化二抗 (間接ABCELISA)相遇時， ABC中未飽和的親合素結(jié)合部位可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反應(yīng)體系與 ABC體系連成一體。間接 BABELISA是在加入抗體后，再用生物素化的二抗，使反應(yīng)增加一個層次，從而使靈敏度進一步提高。 BAELISA中親和素與酶的共價結(jié)合對酶的活性有一定程度的損傷。 3．鏈霉親和素 (streptavidin， SA) 第七章 酶免疫分析技術(shù) 生物素 親和素技術(shù)在 ELISA中的應(yīng)用類型 反應(yīng)層次 直接法 間接法 BAELISA Ag（ AbB） A＊ Ag（ AbB） AB＊ Ag（ AbB） AB＊ C AgAb1（ Ab2B） A＊ AgAb1（ Ab2B） AB＊ AgAb1（ Ab2B） AB＊ C BABELISA ABCELISA A＊為標記親和素 B＊為標記生物素 第七章 酶免疫分析技術(shù) 基本原理： 直接 BAELISA是以酶標親合素直接連接生物素化抗體。親和素與生物素之間的親和力極強，比抗原與抗體的親和力至少高 1萬倍，且具有高度特異性和穩(wěn)定性。 1．生物素 (biotin， B) 第七章 酶免疫分析技術(shù) 利用生物素的羧基加以化學修飾后可制成各種活性基團的衍生物 (活化生物素 )，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。 RIBA已用于血清抗 HCV抗體的測定和分析。陽性反應(yīng)的條帶染色清晰，根據(jù) SDSPAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。將在凝膠中已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至 NC腹上，選用低電壓 (100v)和高電流 (1～ 2A)，通電 45min轉(zhuǎn)移即可完成。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （三）固相膜免疫測定法 基本原理與常規(guī) ELISA相同，不同之處在于DotELISA使用吸附蛋白質(zhì)能力很強的 NC 膜為固相載體，底物經(jīng)酶反應(yīng)后形成有色的沉淀物，使 NC 膜染色。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （二）非均相液相酶免疫測定法 基本原理： 將酶標抗原、待檢抗原與特異性抗體同時混合（平衡法），或先將待檢抗原與特異性抗體混合反應(yīng)一定時間后，再加入酶標抗原（非平衡法），抗原抗體反應(yīng)達到平衡后，加入二抗，經(jīng)離心沉淀后，將游離的酶標記物與結(jié)合的酶標記物（酶標抗原 抗體 二抗復(fù)合物）分離，棄上清液，測定沉淀物中酶的活性。 返回章目錄 第七章 酶免疫分析技術(shù) 第四節(jié) 其他酶標記免疫測定技術(shù) 一、均相酶免疫測定法、固相模免疫測定法等 基本原理 酶標抗原和非標記抗原具有相同的與限量抗體競爭結(jié)合的能力，而酶標抗原與抗體結(jié)合形成酶標抗原 抗體復(fù)合物后，其中的酶活性將被減弱或增強。 5． 比色 要注意波長的選擇。使用洗板機洗滌次數(shù)要適當增加。 2． 溫育 注意反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致，以防止“邊緣效應(yīng)” 。 4． 藥物和毒品測定 如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。 2． 蛋白質(zhì)測定 各種免疫球蛋白、補體組分、腫瘤標志物各種血漿蛋白質(zhì)、同工酶等。 （ 5）以強陽性抗原的 A值在 、陰性參考的 A值小于 ，據(jù)此選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度。溫育，洗滌。 （ 2）在一個橫行各包被孔中加入強陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對照液，溫育，洗滌。 （ 5）選擇強陽性參考血清的 A值為 ，陰性參考血清的 A值小于 作為工作濃度。 （ 3）加按工作濃度稀釋的酶標抗人 IgG抗體，溫育，洗滌。 1．酶標抗抗體工作濃度的選擇 第七章 酶免疫分析技術(shù) （ 1）用包被液將抗原作一系列稀釋后包被，洗滌。 （ 3）加底物顯色。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 三、最適工作濃度的選擇 （一）間接法檢測抗體 （ 1）用 100ng/ml人 IgG進行包被，洗滌。
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1