【正文】 酶固定化技術(shù)對酶的性質(zhì)可能會產(chǎn)生哪些影響？? 2.? 特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的 共價鍵不發(fā)生改變 ，只是在物理因素的作用下， 副鍵發(fā)生某些變化和重排 。氨基酸置換修飾（七） 核苷酸置換修飾? 將酶分子核苷酸鏈上的某一個核苷酸換成另一個核苷酸的方法。置換修飾的方法化學修飾法（六） ? 修飾后，該酶 失去 對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻 出現(xiàn) 了催化硝基苯酯等底物水解的活性。? 提高酶活力? 增強酶的穩(wěn)定性? 改變酶的專一性置換修飾的作用（六） 若將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，則會引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變，從而改變酶的催化特性，這種修飾方法，稱為 氨基酸置換修飾 。在特定位置上和各種氨基酸是酶的化學結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的基礎。（六） a、胃蛋白酶原的激活 （四） （四） 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾 )? 利用酶分子 主鏈的切斷和連接 ，使酶分子的化學結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。? 雙功能試劑 可以在酶分子中相距較近的兩個側(cè)鏈集團之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性。? 修飾酚基的方法有：碘化法、硝化法、琥珀?；ǖ?。? 主要有：環(huán)己二酮、乙二醛、苯乙二醛等精氨酸胍基修飾反應五、 酚基修飾劑 ：? 原理： 酪氨酸殘基 上含有酚基。四、 胍基修飾劑 ：? 原理：精氨酸含有胍基。許多酶分子中存在的巰基通過形成二硫鍵維持蛋白質(zhì)分子的三維構(gòu)象，對維持酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用。? 主要有：乙醇 鹽酸試劑、水溶性的碳化二亞胺等。 氨基修飾反應二、 羧基修飾劑 ：? 定義：可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基反應的小分子化合物。– 原理：這類試劑作用于酶蛋白側(cè)鏈上的氨基或產(chǎn)生脫氨基，或與氨基共價結(jié)合將氨基屏蔽起來，使氨基原有的副鍵改變，從而改變酶蛋白的構(gòu)象。酶分子的側(cè)鏈基團修飾催化活性 /非催化活性基團的修飾? 對非催化基團修飾可改變酶的動力學性質(zhì)，改變酶對特殊底物的束縛能力。（三） 這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。? 酶蛋白的側(cè)鏈基團是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團。? 可以用于研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。? 色氨酸酶經(jīng) PEG修飾后，完全消除該酶的抗原性。用 PEG修飾修飾ASNase，其抗原性可完全消除。例如：? ASNase（天冬酰胺酶）能專一地催化天門冬酰胺形成天門冬氨酸及氨，是治療白血病的有效藥物。Beckman等利用 PEG修飾 SOD使其在血液中的半衰期由幾分鐘提高到數(shù)十小時，降低了抗原性，提高了對胰蛋白酶的消化抵抗功能。例如：? SOD能清除體內(nèi)的超氧負離子，受到醫(yī)藥界的極大關注。通過修飾增加 酶的穩(wěn)定性 ：? 聚乙二醇 是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并 可消除酶的抗原性 ，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。分離 ：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。1. 大分子結(jié)合修飾的方法修飾 ：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、 pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進行修飾。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團進行反應。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。大分子結(jié)合修飾1. 大分子結(jié)合修飾的方法修飾劑的選擇 ：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。大分子結(jié)合修飾? 每分子核糖核酸酶與 合，可以使酶活力提高到原有酶活力的 倍；? 每分子胰凝乳蛋白酶與 11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達到原有酶活力的 共價修飾(二 )共價修飾(二 )? 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過 共價鍵 連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。? 常用的修飾劑 ：右旋糖酐（ dextran）、聚乙二醇（ PEG）、肝素 (heparin)、蔗糖聚合物（ Ficoll）、聚氨基酸等。大分子結(jié)合修飾? 定義： 利用 水溶性大分子與酶結(jié)合 ,使酶的空間 結(jié)構(gòu) 發(fā)生某些精細的改變，從而 改變酶的特性與功能的 方法稱為大分子結(jié)合修飾法。 2. 金屬離子置換修飾的作用? 闡明金屬離子對酶催化作用的影響? 提高酶活力? 增強酶的穩(wěn)定性? 改變酶的動力學特性(二 )（一）酶的金屬離子置換修飾1. 金屬離子置換修飾的方法 酶的分離純化除去原有的金屬離子：加入金屬螯合劑加入置換離子1. 金屬離子置換修飾的方法 p 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中 本來含有金屬離子的酶 。? 若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。? α 淀粉酶中的鈣離子（ Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子 (Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子 (Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（ Zn2+） ,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子 (Cu2+,Zn2+) ? 若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。（ 2）修飾反應的溫度與時間 ? 嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。（ 1） pH與離子強度 ? pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態(tài)。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。（ 1）酶的穩(wěn)定性? 熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、 pH、抑制劑等。 即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)工程的興起與發(fā)展，酶分子修飾與基因工程技術(shù)結(jié)合在一起，使酶分子修飾展現(xiàn)出更廣闊的前景。酶在使用中的缺陷有：穩(wěn)定性差、活力不夠高、抗原性等，如對酸、堿、重金屬、有機介質(zhì)、高溫等物理化學環(huán)境敏感，且活性、專一性、作用條件不能滿足生產(chǎn)工藝要求。酶所具有的反應專一性、催化高效性及反應條件溫和等優(yōu)點，使其廣泛應用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保及能源等領域。第四節(jié) 在連續(xù)測定條件下，固定化酶 (細胞 )的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以 t1/2表示。半衰期 ? 偶聯(lián)率 =(加入蛋白活力 上清液蛋白活力 )/加入蛋白活力 100%? 活力回收 =固定化酶總活力 /加入酶的總活力 100%? 相對活力 =固定化酶總活力 /3. (BCA法 )? 酶 (細胞 )的活力 ? 固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。? （ 3）最適溫度和最適 pH常保持不變。? （ 1）有活性升高的現(xiàn)象。與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較復雜 。但大分子底物難于接近酶分子，導致酶的專一性發(fā)生改變。酶的作用專一性固定化載體與底物電荷 相同 ，固定化酶的表觀 Km值顯著 增加 。? 5.：最適 pH? ：最適 pH酶的最適 pH ? 多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。? ? 3.（一）、固定化酶的性質(zhì) 可能的原因：① 固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度， 可防止酶分子伸展變形；② 抑制酶的自身降解。? 而固定化后， 酶的耐熱性、對變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。酶的穩(wěn)定性? ：? 1.2.構(gòu)象改變或立體屏蔽以及微擾? 注意：一般要加滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂。 一般采用網(wǎng)格包埋法（即凝膠包埋法）。