生物化學(xué)課件4：酶(參考版)
2025-01-19 13:46本頁(yè)面
【正文】 固定化酶制備方法： 七 .抗體酶 。 作用特點(diǎn)：穩(wěn)定性提高，易分離，可反復(fù)使用，提高操作的機(jī)械強(qiáng)度。 ：不符合米曼方程雙曲線。 ：為小分子，常為底物或產(chǎn)物。 酶原的激活實(shí)質(zhì)上是酶活性部位形成或暴露的過(guò)程。 酶原在一定條件下經(jīng)適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)作用可轉(zhuǎn)變成有活性的酶。它是一類特殊的 RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng) 。 (3).為治療破壞有害基因，腫瘤等疾病提供手段 。 打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。 （ 2）自我切割位點(diǎn)，位于 GUX的 X外側(cè)， X可表示為 C、 U或 A，不能是 G。1983年發(fā)現(xiàn) RNase P中的 RNA可催化 tRNA前體的加工。 第九節(jié) 酶的多樣性 一 .多酶復(fù)合體 由幾個(gè)功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。 ?化學(xué)法 ：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)出的化合物，然后再反過(guò)來(lái)算出酶的活性。在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物是從無(wú)到有，變化量明顯，極利于測(cè)定，所以大都測(cè)定產(chǎn)物的生成量 2).酶活力測(cè)定的分析方法 具體物質(zhì)量的測(cè)定，據(jù)被測(cè)定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過(guò)定量分析法測(cè)定。 有些酶可用非變性法來(lái)停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來(lái)停止反應(yīng) 。 ?常使酶立刻變性最常用的方法： 是加入三氯乙酸或過(guò)氯酸使酶蛋白沉淀。反應(yīng)到時(shí)，要立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時(shí)間。 1） .測(cè)定酶活力常有以下幾種方法 ?反應(yīng)計(jì)時(shí)法 ：反應(yīng)計(jì)時(shí)必須準(zhǔn)確。 酶活力中心轉(zhuǎn)換數(shù) :表示酶的催化中心的活性 ,單位時(shí)間 內(nèi)(sec.)每一 催化中心的活性 或 活性中心所轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，或每 mol酶 活性中心單位時(shí)間轉(zhuǎn)換底物的 mol數(shù) . 轉(zhuǎn)換數(shù) =k3=Vmax/(E0) 酶活力測(cè)定就是測(cè)定一定量的酶，在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物 (P)的生成（增加）量或底物（ S）的消耗（減少）量。 ② 糖化酶活力單位： 在規(guī)定條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生 1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶 ③ 蛋白酶： 規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1μg ④ DNA限制性內(nèi)切酶： 推薦反應(yīng)條件下，一小時(shí)內(nèi)可完全消化 1μg 純化的 DNA 比活力 :指每 mg酶蛋白質(zhì) /蛋白氮所含的酶活力單位數(shù)。 習(xí)慣單位 在實(shí)際使用中，不同酶有各自的規(guī)定，如： α 淀粉酶活力單位： 每小時(shí)分解 1g可溶性淀粉的酶量為一個(gè)酶單位。 如果是 兩個(gè)相同的分子 參加反應(yīng)，則每分鐘催化 2μmol 底物 轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個(gè)酶單位。 ―Katal‖單位：是指在一定條件下 1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化 1mol底物所 需的酶量。 酶活力單位 酶活力單位的基本定義為： 規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。 a. 固體 ：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥） b. 液體： 溶液 低溫下短期保存 04℃ （固體） 20? 70℃ （液體） 二 .酶活力的測(cè)定 酶活力 ：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來(lái)表示。胞內(nèi)酶先要進(jìn)行細(xì)胞破碎（機(jī)械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等）， c. 分離 ： 先進(jìn)行凈化處理（過(guò)濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，超離心等）。 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程： 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的 Lineweaver–Burk圖 ： 第八節(jié)、酶的分離純化與酶活力測(cè)定 一 .酶的分離純化 ? 提取過(guò)程中避免酶變性而失去活性 ? 防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等 ? 要求在低溫下操作 ? 加入的化學(xué)試劑不使酶變性 ? 操作中加入緩沖溶液 a. 選材 ： 微生物（微生物發(fā)酵物 : 胞內(nèi)酶，胞外酶），動(dòng)物（動(dòng)物器臟：消化酶，血液： SOD酶，尿液：尿激酶等） ,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用下式表示： 特點(diǎn)： 非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^(guò)增大底物濃度的方法來(lái)消除 。 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制可用下式表示： 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程： ?有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)， V值減小 (1+[I]/Ki)倍， 且 V值隨 [I]的增高而降低； ?Km值不變。 如某些金屬離子（ Cu2+、 Ag+、 Hg2+）以及 EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的 SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。 競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的 Lineweaver–Burk圖 ： （ 2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制： 概念： 酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。 特點(diǎn)： 竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^(guò)增大底物濃度，即提高底物的 競(jìng)爭(zhēng)能力來(lái)消除。抑劑 可以通過(guò)透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性 根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類： （ 1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制： 概念： 某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)? 與酶活性中心結(jié)合。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。 ?定的復(fù)合體或結(jié)合物。 五 .抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響 （一） .酶的抑制作用的概念 有些物質(zhì)能與酶分子上某些必須基團(tuán)結(jié)合（作用 ),使酶的活性中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為 酶的抑制作用 。 ：其中大部分是一些無(wú)機(jī)離子和小分子簡(jiǎn)單有機(jī)物。 速度 酶濃度 三 .酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響 在底
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