pcr引物設計黃金原則(參考版)
2025-01-19 05:18本頁面
【正文】 。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備尋找合適的引物非常不容易。 至于設計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應該可以的。 7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C. 5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。引物設計的要求： 1)避免重復堿基，尤其是G. 2)Tm=5860度。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。 引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。若不能避開這一區(qū)域時，用7deaza2′脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G176。 某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。3′ 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失
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