最新引物設(shè)計原則必看(參考版)
2025-07-03 02:43本頁面
【正文】 隨著人們對引物的認(rèn)識，一些引物的計算機設(shè)計程序也應(yīng)運而生，下面將討論有關(guān)引物計算機設(shè)計方法。 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增特異性與效率。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV1 gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。 ′端 引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。 兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。若按公式Tm=4（G C） 2（A T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。 C含量 G C含量一般為40%~60%。 寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。），擴(kuò)增往往不能成功。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。 ⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。 ⑧ 引物5′端可以修飾。 ⑥ 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 ④ G C含量在40%~60%之間。 ② 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。 引物確定以后，可以對引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴(kuò)增的特異性影響不大。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計引物。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。一般引物序列中G C含量一般為40%~60%。一般引物長度為15~30堿基，擴(kuò)增片段長度為100~600堿基對。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物。同時應(yīng)預(yù)測將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥壗Y(jié)構(gòu)。因此，引
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