最新引物設(shè)計原則必看(編輯修改稿)
2025-07-27 02:43 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴(yán)重3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增使Pair Rating 匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因為在同樣退火溫度下Tm低的引物決定擴增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯誤的起始【1】引物的長度以15－30bp為宜，否則會影響擴增的特異性。【2】 】堿基盡可能隨機分布，避免相同的堿基成串排列，引物的G+C含量在40％－60％之間，若G+C含量太低，可在539。端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在539。端加上一些A或T?！?】 應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)及兩條引物的339。端互補形成引物二聚體，避免在引物的339。端有3個G或3個C成串排列，339。端的末位堿基最好選T、C、G,而不選A，也有建議在引物的兩端用1－2個嘌呤堿基。【4】 盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過5℃），退火溫度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計軟件大多數(shù)都采用這種方式。（注：對于Tm值的計算有爭議的地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)該計算在內(nèi)，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來的PCR反應(yīng)中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【5】 引物的3’端要與模板嚴(yán)格配對，而5’端堿基沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的部分足夠長，其5’端堿基可不與模板DNA配對而呈游離狀態(tài)，這樣，我們可以在引物的5末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進(jìn)行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作。【6】 不要在擴增序列的二級結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計引物，以免退火困難。也要考慮引物設(shè)計處模板的特異性。PCR引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增
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