【正文】 ● 離子交換纖維素層析法 DEAE纖維素 （ 二甲胺基乙基纖維素 ）和 ECTEOLA（ 3氯 1， 2環(huán)氧丙烷三乙醇胺纖維素 ） ： 分離酸性 、 中性多糖和粘多糖 ； ECTEOLA還常用于肝素 、 硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等粘多糖的分離 。 四、分離 ● 凝膠層析法 對于不同聚合度的糖類及其水溶性成分的分離特別有效， 方法快速、簡單、條件溫和。 ● 分級沉淀法 是利用多數(shù)糖可溶于水，三糖以下尚可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，在乙醇中溶解度逐步降低的性質(zhì)， 在糖的水溶液中分次加入乙醇，使醇濃度漸增，從而達到對糖進行粗略分離目的 的方法。 ◆ 注意：處理時間應盡可能的短 ， 并在低溫下進行 ，以免多糖降解 。 ▲ 一般說來 ， 糖苷類成分大多在甲醇 、 乙醇 、丙酮 、 正丁醇 、 乙酸乙酯中溶解度較大 ， 提取效率較好 ， 又能抑制酶 ， 故為優(yōu)選溶劑； 然而 ，水也為常用溶劑 ， 尤其是糖的提取 ， 可選用熱水提取 ， 但雜質(zhì)較多 ， 同時應注意共存有機酸的影響 ， 必要時可用緩沖液 。 ▲欲提取次生苷或苷元，需利用酶 ，如發(fā)酵等。 但以下問題則是提取分離糖及其苷類成分時 必須考慮的共同點 。 利用酶解法推斷苷鍵構型時需注意并非所有的 α 苷鍵都能被苦杏仁苷酶所水解 。 確定苷鍵構型的方法主要有以下幾種 。 OOOO OOCH=CHOCO CHOHOHOHOCH3OCH3OHH CO3HOOH234m/z 305m/z 161M305=657M161=801FDMS of marsdekoiside A [M] =962+202264 70 ▲ NMR法測定糖鏈連接順序 是將糖及其苷類衍生物全乙?；螅瑴y定觀察 兩糖之間質(zhì)子的遠程偶合或 NOE效應 ，以期確定糖的連接順序。 202264 69 ▲ MS法測定糖鏈連接順序 ◆ 技術 → FDMS、 FABMS等。 OOOO OOCH=CHOCO CHOHOHOHOCH3OCH3OHH CO3HOOH234 糖鏈連接順序的確定 經(jīng)典方法： 緩和水解；酶解；乙酰解 等 這些方法都是將苷部分裂解成 次級苷 或 低聚糖， 再分析鑒定糖的碎片。 將苷或低聚糖先行甲醚化或乙?；?， 測得其13CNMR譜 ， 然后將其水解 ， 再測其水解產(chǎn)物的13CNMR譜 ， 歸屬比較其變化 ， 以推斷苷鍵的連接位置 。 此外利用 二維 1H1H相關譜和 1H13C相關譜 ， 也是確定苷中糖的數(shù)目的有效方法 。 近年來： 利用 質(zhì)譜 測定苷和苷元的分子量的差值 ， 求出糖的數(shù)目 。 組成苷中糖的種類鑒定 通常采用 PC、 TLC、 GC或 HPLC等方法對水解液進行鑒定，也可以直接通過解析苷的二維 NMR譜進行鑒定。 (三 ) 組成苷的苷元和單糖的鑒定 將苷用稀酸或酶進行水解，使生成苷元和各種單糖，然后再對這些水解產(chǎn)物進行鑒定。 第六節(jié) 糖鏈的結構測定 （二） 分子量測定 ▲單糖、低聚糖及其苷 的分子量測定：目前 主要用 MS法 ，但由于它們?yōu)槎嗔u基化合物，普通 EIMS往往測得的最高質(zhì)量峰為 MH2O，而并非分子離子峰；所以， 多采用 FDMS、 FABMS等。 一、研究糖鏈結構的一般程序 （一）純度鑒定 ▲多糖 的純度鑒定：多用 比旋度法 (恒定不改變 )；高壓電泳法，熔點， TLC、 HPLC。 例如： C1 位移 C2 位移 β D葡萄糖 甲基 β D葡萄糖苷 + β D半乳糖 甲基 β D半乳糖 + α L鼠李吡喃糖 甲基 α L鼠李糖苷 + 定義：糖苷化后 ，端基碳和苷元 α C化學位移值均 向低場移動 ，而鄰碳稍向高場移動（偶而也有向低場移動的），對其余碳的影響不大，這種苷化前后的化學變化，稱苷化位移。 二 、 糖的 13CNMR特征 １ 、 糖上碳信號可分為幾類 ， 大致范圍為： ? CH3→δ 18(甲基五碳糖的 C6)； ? CH2OH→δ 62(C5或 C6)； ? CHOH→δ 70∽ 85(C2\C3\C4)； ? 端基碳 → δ 95∽ 110（ α 型的為 97～ 101， 而 β 型 的為 103～ 106ppm） ； ? 糖上甲氧基碳 → δ65 。 OHO H O RHOHO HHO ROHR OC3O HHOO RHC3O HHOHO H O RHOHOHH O H 2 C OHOHO RHOHOHH O C H 2βD甘露糖苷 αD甘露糖苷 利用 門控偶技術 可以得到 端基質(zhì)子和端基碳的偶合常數(shù) ，即 1JC1H1來區(qū)別。 C 1 HC2H近60（ 雙面角）J =3~ 4 H z。 ， J＝ 6～ 8Hz α D和 β L型糖： 1H為平伏鍵， 2H雙直立鍵， φ ＝ 60176。 四、過碘酸裂解反應（ Smith降解法） 所用試劑為： NaIO NaBH 稀酸 適用范圍： 苷元不穩(wěn)定的苷和碳苷（得到連有一個醛基的苷元） 不適合： 苷元上有鄰二醇羥基或易被氧化的基團的苷。 酶專屬性高，選擇性地催化水解某一構型的苷。 特點： 用酶水解苷鍵可以獲知苷鍵的構型。 二、堿催化水解 C2OH與苷鍵成 反式 易于堿水解，得到 1,6糖酐；成順式 則得到正常的糖。 通常苷鍵對堿穩(wěn)定，不易被堿水解。 (三）局限性 有時會導致苷元結構改變 不能反應糖和糖的連接位置 （四）兩相水解法 對酸不穩(wěn)定的苷元，為了防止水解引起苷元結構的改變，可用兩相水解反應。 （一）反應的 機理 ： OO R O O+RHOH+OH++ H+ H+ R O H+ R O HO O+H2HOH , O H + H++ H2O H2O H++