【正文】 5. DNA 測(cè)序法 （ DNA Sequencing） ? DNA 直接測(cè)序技術(shù)是以 PCR 擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物 ， 采用循環(huán)測(cè)序法對(duì) PCR 擴(kuò)增的雙鏈 DNA 進(jìn)行直接測(cè)序 。該方法是通過(guò) PCR 擴(kuò)增一段 DNA 片段，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)電泳，可得到有種屬特異性的電泳譜帶，從而達(dá)到品種鑒定的目的。 ④ 較之常規(guī) PCR ， RAPD 反應(yīng)易于程序化。② 每個(gè) RAPD 反應(yīng)中，僅加單個(gè)引物，通過(guò)引物和模板 DNA 鏈隨機(jī)配對(duì)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增沒(méi)有特異性。 通過(guò)對(duì) PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)和比較 ， 即可識(shí)別這些物種基因組 DNA 的多態(tài)片段 。 ? RAPD 技術(shù)建立在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上 ， 它是以任意序列的寡核苷酸單鏈為引物 ， 對(duì)所研究的基因組 DNA 進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增 。 3. 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA( RAPD） 和任意引物 PCR(APPCR) ? RAPD（ random amplified polymorphic DNA） 是 1990 年美國(guó)杜邦公司科學(xué)家 J. G. K. Williams 和加利福尼亞生物研究所 J. Welsh 領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù) 。 每完成一個(gè)循環(huán)需 24min， 23h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍 。 2. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction ， PCR) ? 是 80 年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù) ， 以待擴(kuò)增的兩條 DNA 鏈為模板 ， 由一對(duì)人工合成的寡核苷酸作為介導(dǎo) ， 通過(guò) DNA 聚合酶促反應(yīng) ， 在體外進(jìn)行特異 DNA 序列擴(kuò)增 。 ? 一般應(yīng)用 Southern 雜交檢測(cè)這種多態(tài)性 ，將瓊脂糖凝膠中的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 （ 或其它膜 ） 上 ， 然后再用標(biāo)記的克隆基因作探針進(jìn)行雜交 ， 經(jīng)放射自顯影后即可在 X 光片上看到 DNA 多態(tài)性了 。 ? DNA 分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為三類： ? 一是以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心的 RFLP 等技術(shù)； ? 二是以電泳技術(shù)和 PCR 技術(shù)為核心的 RAPD 、 APPCR 等 DNA 分子指紋技術(shù)和 DNA 測(cè)序技術(shù)等； ? 三是前兩類技術(shù)結(jié)合的 AFLP 、 RFLPPCR 、 RAPDPCR 和基因芯片等。 ? 在細(xì)胞分裂的過(guò)程中遺傳物質(zhì)由親代遺傳給子代。 ? 學(xué)科發(fā)展的需要以及分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使 DNA 分子遺傳標(biāo)記鑒別生藥應(yīng)運(yùn)而生。 ? 朗伯 比爾定律： A = ECL 式中 A 為吸收度 ； E 為吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度的吸收度數(shù)值； C 為溶液濃度； L 為液層厚度。另外還有兩種藥材的農(nóng)藥殘留也是用 GC 法分析 ? 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? HPLCUV， 無(wú) UV吸收的皂苷類 HPLCELSD分析方法 ? 《中國(guó)藥典》 (2022 版）一部應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定含量的中藥品種達(dá) 479 種，涉及 518 項(xiàng)，其中藥材就有 98 種 。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。 ? 《中國(guó)藥典》 (2022 版 ) 一部 TLC用于定性鑒別的達(dá) 1523 項(xiàng)，用于含量測(cè)定的為 45 項(xiàng)，其中有 4 種藥材采用薄層掃描法定量。 一、物理常數(shù) ? 物理常數(shù)包括相對(duì)密度、旋光度、折光率、凝點(diǎn)和熔點(diǎn)等； 二、一般理化鑒別 ? 呈色反應(yīng) ? 沉淀反應(yīng) ? 泡沫反應(yīng)和溶血指數(shù)的測(cè)定 ? 微量升華 ? 顯微化學(xué)反應(yīng) ? 熒光分析 三、色譜法 ? 由于現(xiàn)代色譜分析技術(shù)具有 分離和分析兩種功能，即能排除復(fù)雜組分間的相互干擾，逐個(gè)將組分進(jìn)行定性和定量分析，因此，現(xiàn)代色譜分析技術(shù)非常適合成分復(fù)雜的生藥的有效性評(píng)價(jià)。 （十三）礦物類藥材 ? 一般 無(wú) 植（動(dòng)）物顯微特征 ? 晶體 的大小、直徑或長(zhǎng)徑 ? 晶型 的棱角、銳角或鈍角 ? 色澤、透明度、表面紋理及方向、光潔度 ? 偏光顯微鏡下的特征 （十四）中成藥顯微鑒別要點(diǎn) ? 了解組方生藥、劑型和制法 ? 根據(jù)處方明確專屬特征 第五節(jié) 理化鑒定 ? 生藥的理化鑒定 （ physical and chemical identification） 是利用 物理的或化學(xué)的 方法 ，對(duì)生藥中所含主要化學(xué)成分或有效成分進(jìn)行 定性定量分析 。 ? 分泌物和病理產(chǎn)物應(yīng)注意團(tuán)塊的顏色及其包埋物的性質(zhì)特征 ， 表皮脫落組織 ， 毛茸及其它細(xì)胞的形狀 、 大小 、 顏色等特征 。 （ 十二 ） 動(dòng)物類藥材 ? 動(dòng)物全體應(yīng)注意 皮膚碎片 細(xì)胞的形狀與色素顆粒的顏色 ， 肌纖維的形態(tài) ， 剛毛 的形態(tài) 、 大小及顏色 ， 體壁碎片 顏色 、 表面紋理及菌絲體 ， 骨碎片 ， 骨陷窩的形態(tài)等 。 （ 十一 ） 菌類藥材 ? 大多以子實(shí)體或菌核的形式入藥 ， 無(wú) 淀粉粒和高等植物的顯微特征 。 （ 十 ） 全草類藥材 ? 大多為草本植物的地上部分，少數(shù)為帶根的全株。 ? 2. 粉末特征 ? 種皮的表面觀及斷面觀形態(tài)特征。 有的種皮只有 1 列細(xì)胞 ， 較多的種皮由數(shù)種不同的細(xì)胞組織構(gòu)成 。 含有種子的果實(shí)類藥材 ， 注意種皮 、 胚乳組織等特征 。 內(nèi)果皮 的變異較大 ， 有的為 1 列薄壁細(xì)胞 ， 有的散在石細(xì)胞或結(jié)晶細(xì)胞層等 。 ? 外果皮 為 1 列表皮細(xì)胞 ， 觀察注意點(diǎn)同葉 。 ? （ 八 ） 果實(shí)類藥材 ? 組織構(gòu)造 ? 一般觀察果皮的組織特征 。 ? 苞片、花萼的構(gòu)造，與葉相似。 ? 3. 粉末特征 ? 與葉的表面制片基本一致 ， 但毛茸多碎斷 ，粉末中還可見(jiàn)到葉片的橫斷面及晶體 。 ? 2. 葉的表面制片 ? 主要觀察表皮細(xì)胞 、 氣孔及各種毛茸的全形 ， 以及葉肉組織的某些鑒別點(diǎn) ， 如草酸鈣結(jié)晶類型及其分布等 。 ? 2. 粉末特征 ? 以導(dǎo)管、木纖維、木薄壁細(xì)胞、木射線細(xì)胞的形態(tài)特征，以及細(xì)胞后含物為主要鑒別點(diǎn)。 ? 不 應(yīng)有木質(zhì)部的組織，如導(dǎo)管、管胞等。 ? 多數(shù)皮類藥材含淀粉粒 ， 但較微小 。 ? 韌皮部 占皮的絕大部分 ， 韌皮部及皮層往往有 厚壁組織 （ 纖維或石細(xì)胞 ） 存在；有的皮類藥材的韌皮部中 ， 纖維或石細(xì)胞切向集結(jié)成若干層帶 ( 硬韌部 ) ， 與篩管群 、薄壁組織 ( 軟韌部 ) 相間排列 。 （ 四 ） 皮類藥材 ? 1. 組織構(gòu)造 ? 包括 木栓組織 、 皮層及韌皮部 ? 木栓組織 應(yīng)注意木栓細(xì)胞的層數(shù) 、 顏色 、細(xì)胞壁的增厚程度等 。 ? 裸子植物莖的木質(zhì)部主為管胞 ， 通常無(wú)導(dǎo)管 ， 但麻黃莖的構(gòu)造與雙子葉植物草質(zhì)莖類同 。 ? 木質(zhì)莖 最外為木栓組織；皮層多為次生皮層；中柱鞘厚壁組織多連續(xù)成環(huán)或斷續(xù)；形成層環(huán)明顯；次生韌皮部及次生木質(zhì)部呈筒狀結(jié)構(gòu)；射線較窄 ， 細(xì)胞壁常木化；髓較小 。 ? 蕨類植物根莖只有管胞。鱗莖的鱗葉表皮?？刹煲?jiàn)氣孔。 ? 2. 粉末特征 ? 與根類相似。 ? 有的根莖類藥材有油室或油細(xì)胞；有的含草酸鈣針晶束 ， 針晶束大多存在于粘液細(xì)胞中 。 較粗的根莖 、 塊莖等的內(nèi)皮層不明顯 。 少數(shù)種類有三生構(gòu)造 。 中柱的類型 ， 有的是原生中柱 ， 木質(zhì)部 ( 只有管胞 ) 位于中心 ， 韌皮部位于四周 ， 外有中柱鞘及內(nèi)皮層；有的為網(wǎng)狀中柱 ， 在橫切面可見(jiàn)數(shù)個(gè)分體中柱斷續(xù)排列成環(huán)狀 ，每一分體中柱為一原生中柱狀 。 ? 注意淀粉粒的多少 、 形狀 、 類型 、 大小 、臍點(diǎn)形狀及位置 、 層紋等特征 。 ? 分泌組織 觀察時(shí)應(yīng) 注意分泌細(xì)胞 、 分泌腔 （ 室 ） 、 分泌管 （ 道 ） 及乳汁管的類型 、 分泌細(xì)胞的形狀 、 分泌物的顏色 、周圍細(xì)胞的排列及形態(tài)等特征 。 ? 導(dǎo)管 一般較粗 ， 應(yīng)注意其類型 、 直徑 、導(dǎo)管分子的長(zhǎng)度及末端壁的穿孔 、 紋孔的形狀及排列等 。 ? 粉末特征 ? 除葉肉組織 外 ， 其它細(xì)胞 、 組織碎片都可能存在 。 ? 有些雙子葉植物根有異常 三生構(gòu)造 ， 例如何首烏根的形成層環(huán)外方有數(shù)個(gè)異常復(fù)合維管束 。 掃描電子顯微鏡 ? 分辨率高 ? 圖像