表達產(chǎn)物的分離純化(參考版)
2025-05-18 06:06本頁面
【正文】 （六）重組蛋白的質(zhì)量檢測 工業(yè)化生產(chǎn)的重組蛋白必須經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制才能成為產(chǎn)品。 含配體溶液 混合蛋 白樣品 平衡液 帶有配體的樹脂珠 收集目 的蛋白 洗下未結(jié) 合的蛋白 目的蛋白 配體 配體與 樹脂珠結(jié)合 實際上 ， 特殊性洗脫法是一種非特異性洗脫方法 。 使用 特異的配基 作為洗脫劑。 酸酐法 N取代羥基琥珀酰亞胺法 疊氮化作用 還原性烷基化合物 (西夫堿 )的形成 配基的偶聯(lián) 親和層析的基本操作 采用改變 pH、 離子強度 、 離子種類 、溫度 ， 使與固定配基結(jié)合的生物大分子構(gòu)象發(fā)生變化 ， 降低其親和力 。 親和層析載體的性質(zhì)與選擇 有多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ， 能使吸附的大分子自由通過； 親和層析載體的選擇 均勻珠狀顆粒具有良好的機械性能 、 良好的流速； 有相當量的易活化基團 ， 溫和條件下能與配基共價偶聯(lián)； 具有惰性 ， 盡量減少非專一性吸附； 在偶聯(lián) 、 吸附和洗脫時 ， 有較好的理化穩(wěn)定性 。 抗原與抗體； DNA與互補 DNA或 RNA； 酶與其底物、競爭性抑制劑、輔酶因子； 激素或藥物與其受體； 維生素與其特異性結(jié)合蛋白； 糖蛋白與其相應(yīng)的植物凝集素。 4） 必須針對某一分離對象 ， 制備專一配基 ， 應(yīng)用范圍受一定限制 。 親和層析的基本特點 1）純化過程簡單、迅速，分離效率高。 平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時需要的流速； 平衡和洗脫時應(yīng)維持流速恒定； 上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求確定： 進樣體積 分級分離 ：樣品溶液的體積要小 (12%)， 使樣品層盡可能窄 ， 這樣洗脫出的峰形好 。 凝膠層析的基本操作 注意凝膠的斷層和氣泡。 2）分級分離 一般選排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠 。 1）組別分離 一般選 Sephadex G25或 G50， 對于小肽和小分子物質(zhì)的脫鹽 ， 可選 Sephadex G G1BioGel P2或 P4。 控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠 ，交聯(lián)劑越多 、 孔隙越小 。 聚丙烯酰胺凝膠商品名為 BioGel， 型號從 P2至 P300共 10種 （ 數(shù)字 1000為排阻限度 ） 。 瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠 ， 適于分離分子量較大的生物大分子 （ 如蛋白質(zhì) 、 DNA） 。 Sephadex LH是羥丙基化的 Sephadex，流動相既可使用緩沖水溶液 ， 也可使用極性有機溶劑 ， 因此適用于 非水溶性溶質(zhì) 的凝膠過濾 。 注意： 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 葡聚糖凝膠對堿穩(wěn)定 ， 在酸性環(huán)境中糖苷鍵易水解；濕態(tài)的葡聚糖可加熱到 110℃ ， 干的能耐受 120℃ 高溫 。 大分子物質(zhì) 不能進入凝膠顆粒內(nèi)部 ， 隨洗脫液從凝膠顆粒之間的空隙擠落下來 ， 遷移速度快 ； 原理： 分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的 ， 會被全部排阻在凝膠顆粒之外 ， 即使大小不同 ， 也不能分開 ， 它們的下行速度快 。 樣品洗脫 恒定洗脫 梯度洗脫 線性洗脫 10 20 30 40 50 60 70 80 90
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