表達(dá)產(chǎn)物的分離純化(完整版)
【正文】 平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、 pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中 pH值最重要。 注意： 凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì) 葡聚糖凝膠對(duì)堿穩(wěn)定 ， 在酸性環(huán)境中糖苷鍵易水解；濕態(tài)的葡聚糖可加熱到 110℃ ， 干的能耐受 120℃ 高溫 。 控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠 ，交聯(lián)劑越多 、 孔隙越小 。 平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時(shí)需要的流速； 平衡和洗脫時(shí)應(yīng)維持流速恒定； 上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求確定： 進(jìn)樣體積 分級(jí)分離 ：樣品溶液的體積要小 (12%)， 使樣品層盡可能窄 ， 這樣洗脫出的峰形好 。 親和層析載體的性質(zhì)與選擇 有多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ， 能使吸附的大分子自由通過(guò)； 親和層析載體的選擇 均勻珠狀顆粒具有良好的機(jī)械性能 、 良好的流速； 有相當(dāng)量的易活化基團(tuán) ， 溫和條件下能與配基共價(jià)偶聯(lián)； 具有惰性 ， 盡量減少非專(zhuān)一性吸附； 在偶聯(lián) 、 吸附和洗脫時(shí) ， 有較好的理化穩(wěn)定性 。 （六）重組蛋白的質(zhì)量檢測(cè) 工業(yè)化生產(chǎn)的重組蛋白必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制才能成為產(chǎn)品。 酸酐法 N取代羥基琥珀酰亞胺法 疊氮化作用 還原性烷基化合物 (西夫堿 )的形成 配基的偶聯(lián) 親和層析的基本操作 采用改變 pH、 離子強(qiáng)度 、 離子種類(lèi) 、溫度 ， 使與固定配基結(jié)合的生物大分子構(gòu)象發(fā)生變化 ， 降低其親和力 。 親和層析的基本特點(diǎn) 1）純化過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速，分離效率高。 1）組別分離 一般選 Sephadex G25或 G50， 對(duì)于小肽和小分子物質(zhì)的脫鹽 ， 可選 Sephadex G G1BioGel P2或 P4。 Sephadex LH是羥丙基化的 Sephadex，流動(dòng)相既可使用緩沖水溶液 ， 也可使用極性有機(jī)溶劑 ， 因此適用于 非水溶性溶質(zhì) 的凝膠過(guò)濾 。 為達(dá)滿(mǎn)意的分離效果 ， 進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的 1020%。 常用的離子交換葡聚糖： C后面的數(shù)字 = 凝膠吸水量 ? 10 C25：表示 1g干燥的凝膠可吸水 DEAESephadex A25 QSephadex A25 DEAESephadex A50 QSephadex A50 CMSephadex C25 SP Sephadex C25 CMSephadex C50 SP Sephadex C50 陽(yáng)離子型： 陰離子型： 4）離子交換瓊脂糖 CMSepharose 是攜帶 DEAE或 CM基團(tuán)的 Sepharose CL6B，具有硬度大 、 性質(zhì)穩(wěn)定 、 流速好 、 分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) ， 受 pH和離子強(qiáng)度影響引起的膨脹和收縮效應(yīng)小 ， 外形和體積穩(wěn)定 。 常用的離子交換劑 1）離子交換樹(shù)脂 常見(jiàn)的是含酸性或堿性基團(tuán) 、 人工合成的聚苯乙烯 二乙烯苯不溶性高分子化合物 。 3） 若有兩種以上成分吸附在離子交換劑上 ， 各成分被洗脫的可能性取決于各自反應(yīng)的解離常數(shù) 。 透析的用途： 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)分離純化 。 首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法； 選擇分離純化方法時(shí)，應(yīng)遵循下列 原則 ： 選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)
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