表達(dá)產(chǎn)物的分離純化(更新版)
【正文】 合使用； 盡量選擇高效的分離方法； 將最費(fèi)時、成本最高的分離純化方法排在最后。五、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 重組蛋白分離純化方法選擇的原則 透析和超濾 離子交換層析 凝膠層析 親和層析 原核生物表達(dá)的重組蛋白質(zhì)量檢測 （一）重組蛋白分離純化方法選擇的原則 針對不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略 針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型 多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用 合適分離純化介質(zhì)的選擇 分離純化過程的規(guī)模化 針對產(chǎn)物的表達(dá)形式采取不同的策略 應(yīng)先離心回收包涵體 。 多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用 重組蛋白純化時，通常需綜合使用多種技術(shù)。 脫鹽； 去除小分子雜質(zhì)； 置換緩沖液 。 2） 所含 可解離基團(tuán) 在水溶液中能與其它陰 、 陽離子起交換作用 。 弱陰離子交換劑： 弱陽離子交換劑： pH升高時，電離率逐漸降低，離子 交換能力逐漸減弱。 3）既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng)。 離子交換層析的基本操作 樣品進(jìn)柱 交換容量： 離子交換劑中可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)。 1）葡聚糖凝膠 種類有 Sephadex G G1 G2 G50、G7 G100、 G150、 G200， G50表示 1g干凝膠吸水量為 5ml。 凝膠介質(zhì)的選用原則 將樣品中的大分子和小分子物質(zhì)分開 ， 稱為組別分離 ， 分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻， 小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi) 。 組別分離 ：樣品溶液最大可為柱體積的 10%； （五）親和層析 親和層析的基本概念 親和層析載體的性質(zhì)與選擇 親和層析配基的性質(zhì)與選擇 親和層析的基本操作 親和層析的基本概念 親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配體之間的 特異性親和力 ， 進(jìn)行分離的一類 特殊的層析技術(shù) 。 纖維素 葡聚糖凝膠 瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 常用的親和層析載體 親和層析配基的性質(zhì)與選擇 純化對象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力； 親和層析配基的選擇 親和力太高也有害 ， 在解離配基復(fù)合物時所需的條件就強(qiáng)烈 ， 可能使生物分子變性； 配基必須有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán) ， 用于連接載體 ，基團(tuán)不參與配基和生物分子之間特異結(jié)合 ， 也不影響二者的親和力 。 重組蛋白的質(zhì)量控制指標(biāo)： 鑒別（序列） 純度（雜質(zhì)的類型） 活性（檢測方法） 安全性 穩(wěn)定性 一致性（構(gòu)象與構(gòu)型） 原核細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物的質(zhì)量檢測項(xiàng)目與方法 檢測項(xiàng)目 檢測方法 是否含內(nèi)毒素 是否變異 甲硫氨酸是否被甲?；? 是否變性、聚合、脫氨基 配體是否脫落 氨基酸是否發(fā)生取代 是否被細(xì)菌、病毒、支原體污染 家兔熱原法 肽譜、 HPLC、 等電聚焦、毛細(xì)管電泳 肽譜、質(zhì)譜、 HPLC、 Edman分析 SDSPAGE、 凝膠層析、等電聚焦、質(zhì)譜、 HPLC、 毛細(xì)管電泳、 Edman分析 SDSPAGE、 免疫分析 氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜、毛細(xì)管電泳 微生物學(xué)檢測
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