【正文】 最后，我要感謝生命科學(xué) 學(xué)院的全體老師以及 07 生物工程班所有同學(xué)們，謝謝你們在四年中對我的關(guān)心和幫助！ 。導(dǎo)師淵博的專業(yè)知識 ， 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度， 精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無華、平易近人的人格魅力對我影響深遠(yuǎn) ，是我學(xué)習(xí)的模范。本實(shí)驗(yàn)是在王老師的悉心指導(dǎo)下完成的。 17 參考文獻(xiàn) [1] 張學(xué)佳 ,紀(jì)巍 ,王寶輝等 .丙烯酰胺生態(tài)毒理行為研究進(jìn)展 .生態(tài)毒理學(xué)報(bào) [J],2020(3):217223 [2] 孔繁翔 .環(huán)境生物學(xué) [M].北京 :高等教育出版社 .2020,200201. [3] Asano Y, Yamada H. A new enzyme nitrile hydratase which degrades acetonitrile in bination with amidase. Agric Biol Chem ,1980 ,44 : P , Arnaud A. Fr 7333613. 1973. [4] Caulfield M J, Hao X J, Qiao G G, et al. Degradation on polyacrylamides. Part I. linear polyacrylamide[J]. Polymer, 2020, 44： 13311337. [5] Nagasawa T. et al. Application of Nitrile Converting Enzymes for Production of useful , Compounds , Pure amp。 （ 4） 計(jì)算 COD （ mg/L） =C(V1－ V2)8000/V0 C標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度， mol/L V2試料測定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積， ml V1空白實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積， V0試料體積， ml 80001/4 O2的摩爾質(zhì)量，以 mg/L 為單位 的換算值 菌株對污水 COD 降解結(jié)果 表 COD 的能力 Table 3 Two strains of ability. COD degrading wastewater 廢水 COD 濃度（ mg/L） 降解前 降解后 降解率（ %） 16 菌株 1 5000 1700 66 菌株 2 4800 2020 菌株對丙烯酰胺除去率結(jié)果 表 Table 4 Two strains degradation of acrylamide ability 丙烯酰胺濃度（ ） 未添加降解菌的 A280 添加降解菌的 A280 除去率（ %） 菌株 1 % 菌株 2 % (1)通過本實(shí)驗(yàn)的研究，可以知道：菌株 1 為革蘭氏陽性桿菌，菌株 2 為革蘭氏陰性菌。 （ 3） 測定水樣同時(shí)，以 重蒸餾水，按同樣操作步驟作空白試驗(yàn)。 （ 2） 冷卻后，用 90mL 水自上沖洗冷凝管，取下錐形瓶，用水稀釋至 140mL 左右。 注 2 廢水中氯離子含量超過 30ml/L 時(shí)，應(yīng)先把 硫酸汞加入回流錐形瓶中，再加 廢水（或適量廢水稀釋至 ），搖勻。如溶液顯綠色，再適當(dāng)減少廢水取樣量，直至溶液不變綠色為止，從而確定廢水樣分析時(shí)應(yīng)取用的體積。自溶液開始沸騰起回流 2 小時(shí)。將錐形瓶接到回流裝置冷凝管下，接冷凝水 。 0102030405060705 6 7 8 9pHDegradation rate % 圖 11 降解率隨 pH 值的變化曲線 the degrading rate under different pH 污水 COD 值測定 15 具體操作如下 【 1516】 （ 1） 取 混合均勻的水樣（或適量水樣稀釋至 ）置于 250ml 磨口的回流錐形瓶中。對丙烯酰胺溶液 14 的降解率進(jìn)行了測定 ，從而確定了降解實(shí)驗(yàn)的最佳溫度。測定不同溫度 20℃、 25℃、30℃、 35℃、 40℃下最優(yōu)菌株對 1000 mg 01020304050607080900 10 20 30 40時(shí)間 ( h)Degradation rate % 圖 8降解率隨時(shí)間的變化曲線 The change of degrading rate in vegetation process of the bacteria 接種量的影響 將最優(yōu)菌株向培養(yǎng)基中分別按不同的體積分?jǐn)?shù) 1%、 2%、 3%、 4%、 5%接種，在已優(yōu)化的條件下培養(yǎng) 2 天后測定丙烯酰胺的降解率。實(shí)驗(yàn)確定了外加碳源、氮源、磷源及其最佳濃度，優(yōu)化了菌株在純培養(yǎng)條件下降解丙烯酰胺的最佳生長條件 【 1214】 。 (圖 2)菌株 1 簡單染色 (圖 3) 菌株 2 簡單染色 Fig 2 Simple stained Fig 3 Simple stained 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線y = + R2 = 0120 1 2 concentration(mg/ml)Absorbence 12 （圖 4）菌株 1 革蘭氏染色 （圖 5）菌株 2 革蘭氏染色 Fig 4 Gram stain Fig 5 Gram stain 生理生化鑒定 （ 1）接觸酶實(shí)驗(yàn)，菌株 1 與菌株 2 均沒有氣泡產(chǎn)生，陰性； （ 2）糖氧化發(fā)酵，菌株 1 和菌株 2 均變黃，沒有氣泡； （ 3）甲基紅試驗(yàn)，菌株 1 為紅色，陽性，菌株 2 為黃色，陰性； （ 4） VP 實(shí)驗(yàn)，菌株 1 與菌株 2 均不變紅，陰性。相關(guān)系數(shù) R2=，曲線方程為 y=+。 在紫外分光光度計(jì)上 260nm 處測定不同濃度的丙烯酰胺溶液隨吸光度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此溶液為 5mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)貯備液。 10 降解率 =（未添加 降解菌的 A280添加降解菌的 A280） /未添加降解菌的 A280 丙烯酰胺含量的測定 為了確定丙烯酰胺的吸收波長，配制不同濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 UNICO UV2100 紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行掃描，最終確定丙烯酰胺的吸收波長為 260nm，以下研究實(shí)驗(yàn)中均采用 260nm的波長測定丙烯酰胺的含量 [911]。 （ 3）方法的適用范圍 用 ，未經(jīng)稀釋水樣的測定上限是 700mg/L。氯離子能被重鉻酸鉀氧化，并且能與硫酸銀作用產(chǎn)生沉淀，影響測定結(jié)果，故在回流前向水樣中加入硫酸汞，使成為絡(luò)合物以消除干擾。根據(jù) 硫酸亞鐵銨的用量算出水樣中還原性物質(zhì)消耗氧的量。接種后輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡，將接種過和作為對照的試管放置 30℃培養(yǎng) 24~48h，發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，氣體的產(chǎn)生可由試管中倒置的德漢式小管中有無氣泡來證明。加少許肌酸， 10 min如培養(yǎng) 液出現(xiàn)紅色，即為試驗(yàn)陽性反應(yīng)。 VP 試驗(yàn) 9 培養(yǎng)基同甲基紅試驗(yàn)。 L1。 L1；葡萄糖， 5 g 接觸酶試驗(yàn) 將培養(yǎng) 24 h 的斜面接種，以玻璃棒沾取少許涂在 3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡為陰性。干燥后，用油鏡觀察。用濾紙吸去載玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用 95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗。鑒定方法主要有革蘭氏染色法、接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、 VP 實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 （ 4）將已經(jīng)純化的兩株菌種分別接種于試管斜面，做好標(biāo)記。 （ 3）待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。用滅菌的竹簽從稀釋涂布平板法得到的平板上挑取單菌落進(jìn)行平板劃線分離。 從廢水中富集培養(yǎng)菌株 菌種的純化 （反復(fù)劃線培養(yǎng)進(jìn)行分離、純化） 用選擇性培養(yǎng)基篩選出優(yōu)勢菌株 優(yōu)勢菌生理生化性質(zhì)測定 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析 菌株生長條件優(yōu)化及污染物降解率測定 8 菌株的分離純化 采用兩次單細(xì)胞挑取法使初步分離的微生物得到純培養(yǎng) [3]。 7