【正文】 測定 于甲、乙兩支比色管中 (50ml)，分別加入 20%可溶性淀粉溶液 25m1 及 的醋酸 醋酸鈉緩沖液 5ml，搖勻， 40℃的恒溫水浴中預(yù)熱 (510min)。 2%可溶性淀粉 稱取可溶性淀粉 2g，然后用少量蒸餾水調(diào)勻，徐徐傾入巳沸的蒸餾水中，煮沸至透明，冷卻定容至 l00ml，此溶液需當(dāng)天配制。 1mol/L 硫酸溶液 量取濃硫酸 ，慢慢加入于 80 m1 蒸餾水中，冷卻后定容至 l00ml，搖勻。 吸取 10ml 待標(biāo)定的碘液放入 250m1 碘量瓶中，以 黃色時，加入 1%淀粉 指示劑 l2 滴，繼續(xù)滴定至無色為終點。 稱取碘化鉀 (K1)36g，溶解在 100m1 蒸餾水中，再加入碘 (I2) 溶解，定容至 1000ml 貯存于棕色瓶中。根據(jù)本液的消耗量與重鉻酸鉀的用量，計算硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度。并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。輕輕振搖使溶解，加 1mol/L 硫酸溶液 40m1搖勻，密塞。 (2)標(biāo)定：取在 120℃下干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀 ．精密稱量。貯于棕色瓶中密封保存，配制后應(yīng)放置一星期標(biāo)定使用。 (1)配制：稱取硫 代硫酸鈉 (Na2S2O3178。 3H2O) 和冰醋酸 (CH3COOH)，用蒸餾水溶解，定容至 1000m1。 6 參考書 （ 1）鄔顯章，《酶的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)》，吉林科學(xué)技術(shù)出版社， 1988 年 實驗 五 糖化酶的測定方法 1 原理 糖化型淀粉酶（即淀粉α 1， 4葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，從淀粉分子非還原性末端開始，分解α 1， 4糖苷鍵生成葡萄糖，反應(yīng)生成的葡萄糖用次碘酸鉀法定量測定，以表示糖化性淀粉酶的活力。 D：平行試驗管的平均光密度 4：試管中反應(yīng)液總體積 (毫升 ) 10：反應(yīng) 10 分鐘 N：稀釋倍數(shù) W：曲的稱取量 (克 ) 5 說明 （ 1）對于同一臺分光光度計與同一批福林 酚試劑，其工作曲線 K 值可以沿用，當(dāng)另配福林 酚試劑時，工作曲線應(yīng)重作。 WNDOK 1104 ??????蛋白酶活力 式中 K：標(biāo)準(zhǔn)曲線中 O178。 見空白管為對照，在 680 納米波長下測光密度，取其平均值。 空白管中先加入 三氯乙酸溶液，再加 lml2%酪蛋白溶液， 15min 后用濾紙過濾。立即加入 2ml 三氯 乙酸溶液， l5min 后用濾紙過濾。 測定 取四支試管，分別加入 1ml 稀釋酶液，其中一支為空白管，三支為平行試驗管。 酶液的制備 準(zhǔn)確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲 2g，用 10~20ml 蒸餾水， 30℃浸提半小時，用濾紙過濾。一般測 3 次，取平均值． 以吸光度為縱座標(biāo)。 3 操作步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 （ 1）按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液 試劑（ ml） 管 號 1 2 3 4 5 6 蒸餾水 10 8 6 4 2 0 100μ g/m1 酪氨酸 0 2 4 6 8 10 酪氨酸最終濃度（μ g/m1） 0 20 40 60 80 100 (2)測定步驟 另取 6 支試管按上表編號分別吸取不同濃度的酪氨酸 1ml，各加入 酸鈉 5m1，再加入已稀釋的福林試劑 1m1。 100μ g/m1 酪氨酸溶液 精確稱取在 l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸 ，逐步加入 (HCl)使溶解，加蒸溜水定容至 100m1，其濃度為 1000μ g/m1。 配制酪蛋白溶液定容時，若泡沫過多，則可加 1~2 滴酒精消泡。配制后應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存。 取 A 液 16ml 與 B 液 1ml 稀釋 1 倍即成 。 A 液：稱取 %乳酸加蒸餾水定容至 1000ml。 (TCA)溶液 稱取三氯醋酸 ，定容至 1000ml。細(xì)菌漏斗 4~5號過濾，置于棕色瓶中保存。再煮沸除去之。 2H2O)25g，水 700ml， 85%磷酸 50m1，濃鹽酸 1000ml，文火回流10h．加入硫酸鋰 (Li2SO4)150g，蒸溜水 50m1，混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再煮沸 l5min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。 2 試劑 福林試劑 于 2020ml 磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉 (Na2WO4 178。藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱，同三氯醋酸中蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。 7 參考書 （ 1）天津輕工業(yè)學(xué)院等，《工業(yè)發(fā)酵分析》，輕工業(yè)出版社， 1980 年 實驗四 蛋白酶活力的測定方法 1 原理 根據(jù)福林試劑 (磷鉬酸與磷鎢酸混合物 )，在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酞類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng) (鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物 )，由于蛋白質(zhì)分子中含有酚基的氨基酸 (如酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等 )，它使蛋白質(zhì)或其水解產(chǎn)物也呈這個反應(yīng)，于是就可利用這個原理來測定蛋白酶活力的強(qiáng)弱， 即以酪蛋白為作用底物，在一定 pH 與溫度下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時間后，加入三氯醋酸，以終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開，經(jīng)過濾后取濾液 (即含蛋白水解產(chǎn)物的三氯醋酸液 )。 (5)斐林溶液與還原糖之間的反應(yīng)因受溶液堿性、加熱濕度和時間以及副反應(yīng)等影響，而沒有嚴(yán)格的定量關(guān)系，不能由當(dāng)量定律來求出試樣中還原糖的含量，只熊根據(jù)在相同實驗條件下消耗相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)還原糖量或由嚴(yán)格相同的實驗條件下得出的還原糖檢索表上 查得相應(yīng)的還原糖量來進(jìn)行計算。 (3)樣品液中還原糖濃度不宜過高或過低，根據(jù)預(yù)備試驗結(jié)果，應(yīng)將樣品液稀釋至還原糖的含量在 1%左右為宜。 (2)滴定過程應(yīng)該始終保持在微沸狀態(tài)下進(jìn)行。 5 計算 %1001% 10 ?????? VnCVV ）（）還原糖（以葡萄糖計 式中 V0：斐林試劑標(biāo)定值 (毫升 ) V：斐林試劑測定值 (毫升 ) C：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度 (克 /毫升 ) n：試樣稀釋倍數(shù) v1：所取試樣稀釋液體積 (毫升 ) 6 說明 (1)滴定速度、三角瓶壁厚度和熱源的穩(wěn)定程度等，對測定精密度影響很大。 正式試驗：吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加 V1 毫升試樣稀釋液和 (V21)毫升 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，補(bǔ)加 [(V0+10)(V1+V2)]毫升水，搖勻，以下同標(biāo)定時操作，總耗糖量為 V毫升。 3 儀器與設(shè)備 （ 1）三角瓶 （ 2）容量瓶 （ 3）分析天平 （ 4）干燥器 （ 5）電熱恒溫干燥箱 （ 6）滴定管 （ 7）稱量瓶 （ 8）移液管 （ 9）電爐 4 測定步驟 斐林試劑的標(biāo)定 吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加 10 毫升水，并從滴定管中預(yù)先加入約 20 毫升 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 (其量控制在后滴定時消耗%標(biāo)準(zhǔn)葡萄搪溶液 1 毫升以內(nèi) )，搖勻，于電爐上加熱至沸，立即以 4~5 秒鐘1 滴的速 度繼續(xù)用 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色消失，此滴定操作需在 1 分鐘內(nèi)完成，總耗糖量為 V0 毫升。 乙液：稱取 117g 酒石酸鉀鈉， 氫氧化鈉， 亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至 1000ml。另外，斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀 (黃血鹽 )，使紅色氧化亞銅沉淀生成可溶性的復(fù)鹽，反應(yīng)終點更為明顯。 5 計算 從附表 21 查得 10 毫升斐林試劑消耗水解糖液體積相當(dāng)于 100 毫升水解糖液中所含葡萄糖量（ G），則 1 毫升水解糖液中含葡萄糖量為 G/100，再乘以斐林試劑校正值，即為 1 毫升水解糖液中實際含葡萄糖量： )(100 gfG ? %% ?????? WfG）粗淀粉（ 式中 500：試樣稀釋體積（ ml） W：試樣重量（ g） ：葡萄糖與淀粉的換算系數(shù) 6 參考書 （ 1）天津輕工業(yè)學(xué)院等，《工業(yè)發(fā)酵分析》，輕工業(yè)出版社， 1980 年 附表 21 斐林試劑糖量表 消耗糖液 體 積 (毫升 ) 相當(dāng)葡萄 糖 量 (毫克 ) 100毫升糖液中所含葡萄糖的量 (毫克 ) 消耗糖液 體 積 (毫升 ) 相當(dāng)葡萄 糖 量 (毫克 ) 100 毫升糖液中所含葡萄糖的量 (毫克 ) 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 327 307 289 274 260 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 實驗三 還原糖的測定 1 原理 原糖的測定采用快速法。 圖 21 水解裝置 校正值的計算： 先求得 10 毫升斐林試劑相當(dāng)?shù)钠咸烟强藬?shù) (F)， F=CV 式中 C：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度 (g/ml) 再從斐林試劑糖量表 (見附表 21)查得 V 毫升時相當(dāng)?shù)钠咸烟强藬?shù) (F0)，斐林試劑校正值 f 為： 00 FCVFFf ?? 定糖 吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加 20 毫升水，并從滴定管中預(yù)先加入適量的水解糖液 (其量應(yīng)控制在后滴定時消耗水解糖液在 1 毫升以內(nèi) )，搖勻，于電爐上 加熱至沸，并保持微沸 2 分鐘。加 2 滴 1％次甲基藍(lán)溶液繼續(xù)用 ％標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色消失，此滴 定操作需在 1 分鐘內(nèi)完成。濾紙過濾濾液用 500毫升容量瓶接收，用水充分洗搽殘渣，然后用水定容至刻度，搖勻，為供試糖液。瓶口按上回流冷凝器或長玻璃管 (約 1 米 )，于沸水浴中回 流水解 3 小時 (圖 21)。 3 儀器與設(shè)備 （ 1）三角瓶 （ 2）長玻璃管 (約 1 米 ) （ 3）容量瓶 （ 4）分析天平 （ 5）干燥器 （ 6）電熱恒溫干燥箱 （ 7）滴定管 （ 8）稱量瓶 （ 9）移液管 （ 10） pH 試紙試驗 （ 11）電爐 （ 12）小銅鍋 4 測定步驟 試樣水解 粗淀粉測定中試樣水解：準(zhǔn)確稱取試樣 ~2 克，置入 250 毫升三角瓶中。 1％次甲基藍(lán)溶液 稱取 1 克次甲基藍(lán)，加 100 毫升水，加熱溶解，貯存于棕色瓶中。 20％鹽酸溶液 量取 20 毫升濃鹽酸，緩慢倒入 80 毫開水中。 乙液：稱取 346 克酒石酸鉀鈉， 100 克氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至 1000 毫升。因次甲基藍(lán)氧化能力較二價銅弱，故待二價銅全部被還原后，過量一滴還原糖立即使次甲基藍(lán)還原，溶液藍(lán)色消失以示終點： =+( C H O H )4H CC H 2 O HO( C H O H ) 4C O O HC H 2 O H+SN( C H 3 ) 2 NN+（ C H 3 ） 2 C l+ H 2 OSHN( C H 3 ) 2 NN ( C H 3 ) 2+ H C l次 甲 基 藍(lán) （ 藍(lán) 色 ）（ 無 色 ） 2 試劑 斐林試劑 甲液：稱取 克硫酸銅 (CuSO4178。平時甲、乙液分別貯存，測定時甲、乙液等體積混合。 斐林試劑由甲、乙液組成。 （ 2）測定水分時，稱量恒重指試樣連續(xù)兩次干燥后，稱量之差不超過 2mg。 計算 %1 0 0% 01 21 ???? WW WW）水分（ 式中 W0：稱量瓶重（ g） W1：干燥前試樣與稱量瓶重（ g） W2：干燥后試樣與稱量瓶重（ g） 4 說明 （ 1）原料的水分測定一般需采用 100105℃烘箱中直接干燥，其結(jié)果較為準(zhǔn)確。 2 儀器與設(shè)備 （ 1）分析天平 （ 2）稱量瓶 （ 3）干燥器 （ 4）電熱恒溫干燥箱 3 測定步驟 準(zhǔn)確稱取約 2 克試樣，置入經(jīng) 100l05℃干燥恒重后的稱量瓶中，在 100105℃烘箱中干燥 34 小時，取出，置入干燥器中冷卻至室溫，稱重。試樣的水分一般是指在 100℃左右直接干燥的情況下，所失去的總量。 1 原理 樣品中的水分受熱后產(chǎn)生的蒸汽壓，高于空氣在電熱干