動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用技術(shù)-wenkub.com
2025-08-01 14:27 本頁(yè)面
【正文】 在這樣的溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢或停止，但經(jīng)長(zhǎng)期保存和復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。 目前冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。一般來(lái)說(shuō)復(fù)溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內(nèi)要完成復(fù)溫。 不同細(xì)胞最適冷凍速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、℃、7℃和200/分。在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時(shí)再?gòu)?fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）。 重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4~5周后，重復(fù)克隆2次。2）直接培養(yǎng)法：實(shí)驗(yàn)室常用。 檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具。2)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無(wú)菌觀念。: 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物進(jìn)化過(guò)程中，DNA序列發(fā)生某些中性突變，突變的結(jié)果是失去或獲得一個(gè)酶切點(diǎn)，因此當(dāng)基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，限制性內(nèi)切酶片斷加長(zhǎng)或縮短；用同源的克隆DNA為探針可以探測(cè)出來(lái)。鑒定內(nèi)容應(yīng)包括:1)細(xì)胞系的細(xì)胞來(lái)源；2)鑒定細(xì)胞系的純度，即除了主類細(xì)胞外，還雜有哪類細(xì)胞；3)細(xì)胞系的穩(wěn)定性，即在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中主要指標(biāo)應(yīng)無(wú)明顯變化；4)累積細(xì)胞系的形態(tài)及其表達(dá)特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來(lái)源細(xì)胞的差異等；細(xì)胞系鑒定指標(biāo)：活細(xì)胞觀察；固定染色觀察培養(yǎng)細(xì)胞。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細(xì)胞不斷地生長(zhǎng)，而且是使培養(yǎng)物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即細(xì)胞系(Cell line)。5）去除死細(xì)胞6）溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。3）培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長(zhǎng)。3）機(jī)械解離細(xì)胞法：比酶法所需時(shí)間短，但細(xì)胞存活率較低。解離細(xì)胞的方法1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時(shí)間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。表面張力：培養(yǎng)液的表面張力有利于培養(yǎng)物粘著于底物上面。溫度：溫度除直接影響細(xì)胞生長(zhǎng)外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時(shí)CO2溶解性增加，從而影響pH。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。5)抗生素:常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動(dòng)物血清。癌細(xì)胞則由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition）3)停滯期（Stagnate phase）： 即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。 2) 指數(shù)生長(zhǎng)期（Logarthmic growth phase）： 細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitotic index，MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。所謂細(xì)胞“
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