【正文】 計量細(xì)胞生長參數(shù) ， 必須考慮細(xì)胞裂解 。 3． 流加培養(yǎng) 流加體積對反應(yīng)器效率影響很大時 ， Fo=0， 但 Fi≠0， 所以 V不是常數(shù) 。 只有在低稀釋速率時，死亡速率才重要。 活細(xì)胞占主導(dǎo)，死細(xì)胞裂解可忽略，即 k l ＝ 0，那么 vapvapfNN ??? ?? )( 當(dāng)活細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗兰?xì)胞時，沒有直接改變細(xì)胞的總濃度，那么活細(xì)胞處于平衡： VNFNdtVNdvaovv ???? 0)(μa為活細(xì)胞表觀比生長率： dak?? ?? 對于連續(xù)培養(yǎng)，反應(yīng)體積恒定，所以 Fi=Fo=F。 只有活細(xì)胞才能分裂 ， 并假定活細(xì)胞不發(fā)生死亡： dlvapNkNN ?? ??μ為真實比生長速率 。 動物細(xì)胞培養(yǎng)的核心參數(shù)是活細(xì)胞濃度 ， 可用細(xì)胞比生長速率 （ μ） 、 比死亡速率 (Kd)和活細(xì)胞分?jǐn)?shù) (fv)來描述 ， 計算生長動力學(xué) 。 對連續(xù)細(xì)胞系 ， 失去了細(xì)胞周期控制 ， 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分會影響細(xì)胞周期 。 第五節(jié) 動物細(xì)胞的增殖行為與培養(yǎng)過程動力學(xué) 一、動物細(xì)胞的增殖周期 單細(xì)胞增殖周期： 細(xì)胞間期 間期 1(G1)、 DNA合成期 (S期 )、 間期 2(G2) 細(xì)胞分裂期 （ M期 ） 。 優(yōu)點 :占地小 ， 產(chǎn)量和質(zhì)量高 ， 成本低 。此時雖然細(xì)胞停止分裂 ， 但細(xì)胞的存活 、 健康和核形態(tài)不變 ， 代謝和分化功能仍可保持?jǐn)?shù)月 。 1－ 3周后可占據(jù)所有的纖維空間 ， 并在纖維外壁表面上堆積成多層 ， 細(xì)胞密度可達(dá) 108/ml。 接種孔 水套層 產(chǎn)物出口 培養(yǎng)基入口 產(chǎn)物出口 培養(yǎng)基入口 內(nèi)膜 外膜 腔室 細(xì)胞 培養(yǎng)基分散后 ,灌入床層 。 固定床反應(yīng)器： 填料為無細(xì)胞毒性的生物兼容性可附著細(xì)胞的惰性材料 ， 可以是不銹鋼 、 玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料 。 (四 )流化床生物反應(yīng)器 細(xì)胞固定在多孔微載體中 ， 培養(yǎng)基以適當(dāng)?shù)牧魉僮韵露辖?jīng)過 ， 使多孔載體處于懸浮的流態(tài)的反應(yīng)器 。 通過計算機控制混合氣體的組分 ， 維持培養(yǎng)基內(nèi)的容氧和 pH值 。剪切力小 ， 細(xì)胞的傷害小 。 主要區(qū)別：較低的高徑比 ，滿足細(xì)胞對溶解氧的需求；低攪拌轉(zhuǎn)速 ， 大幅傾斜度槳葉或無槳 ， 避免機械傷害；圓形罐底 ， 防止細(xì)胞及載體沿體壁的沉積 。 四 、 動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 （ 一 ） 轉(zhuǎn)瓶 最早的大規(guī)模培養(yǎng)的反應(yīng)器 。 2） 利用培養(yǎng)基 ， 降低細(xì)胞代謝廢物 ， 細(xì)胞生長良好 。 截留細(xì)胞方式：過濾系統(tǒng)有兩種 ， 一種是安裝在反應(yīng)器內(nèi)部或外環(huán)的旋轉(zhuǎn)過濾器 ， 另一種是切線過濾設(shè)備 。 稀釋速率可從 0到最大生長速率之間變化 ， 高稀釋速率將帶出細(xì)胞 。 該方式操作簡單 ， 使細(xì)胞密度和產(chǎn)量維持在較高水平 ， 能在較長時間內(nèi)進行持續(xù)生產(chǎn) ， 反復(fù)收獲產(chǎn)物 ， 生產(chǎn)效率高 ，是動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常被采用的方式 。 （ 三 ） 半連續(xù)式操作 動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物中經(jīng)常采用 。 (二 )流加式操作 最常見的流加物質(zhì)是葡萄糖 、 谷氨酰胺等能源和碳源物質(zhì) 。 （ 一 ） 分批式操作 已用于攪拌式反應(yīng)器或氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞 ， 生產(chǎn)單克隆抗體 。 雜交瘤細(xì)胞與海藻酸鈉溶液混合 ， 經(jīng)微囊發(fā)生器 ， 微球滴入氯化鈣溶液中 ， 形成凝膠 ， 然后用聚氨基酸處理 ， 使微球表面成膜 ， 再用檸檬酸去鈣離子 ， 球內(nèi)海藻酸鈉成液態(tài) ，細(xì)胞在在微囊內(nèi)懸浮 。 網(wǎng)格型為高分子凝膠細(xì)網(wǎng)格 ， 而微囊型為高分子半透膜 。細(xì)胞密度高 、 抗剪切力和污染等優(yōu)點 ， 是生產(chǎn)首選方法 。 方法的優(yōu)點是操作簡單 ， 培養(yǎng)條件相對均一 ， 傳質(zhì)和傳氧較好 ， 容易放大培養(yǎng) 。 3. 懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長的培養(yǎng)過程 ,主要對于非貼壁性依賴性細(xì)胞 ， 如雜交瘤細(xì)胞等 。 玻璃 、 聚苯乙烯塑料 、 不銹鋼金屬材料和微載體 、 多孔微載體或多孔微球 。 多孔微載體： 直徑 ～ 5 mm，孔徑 20～ 300 μm，達(dá)占總體積的 85%，可實現(xiàn)細(xì)胞的固定化，達(dá)到高密度培養(yǎng)。 聚丙烯酰胺載體貼壁較快 ， 親水性 。 葡聚糖微載體：帶正電 ， 干粉可在 中吸脹 ， 清洗滅菌后使用 。 多孔微載體或多孔微球 ， 極大地增加了比表面積 ， 如Cytodex1的比表面積達(dá) 6000 cm2/g， Cytopore的比表面積達(dá) 28000 cm2/g。 缺點：操作較煩雜 ， 檢測受到一定限制 ， 培養(yǎng)條件難以均一 ， 傳質(zhì)和傳氧差 ， 放大培養(yǎng)是瓶頸 。 滾瓶是為早期培養(yǎng)所采用 ， 結(jié)構(gòu)簡單 ， 投資少 ， 重復(fù)性好 ，但勞動強度大 ， 占用空間大 ， 產(chǎn)量低 ， 不易控制和監(jiān)測 。 大多數(shù)動物細(xì)胞屬于貼壁依賴性 ， 貼壁培養(yǎng)是動物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法 。 在保護劑存在下 ， 慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng) 。 低溫冷凍保存： 用冷凍保護液 （ 含 10％ 血清的培養(yǎng)液 ， 附加 10％ 甘油或%10%二甲基亞砜 ） 細(xì)胞預(yù)冷 ， 稀釋成 106細(xì)胞 /ml。 要注意消化程度 ， 細(xì)胞對酶的反應(yīng)不同 ， 有的敏感 ， 掌握好適宜的消化時間和方法 ， 不要過度 ， 獲得細(xì)胞濃度均勻 ， 生長速度一致的傳代細(xì)胞 。 動物組織或器官 洗滌 粉碎 酶解消化 離心或過濾 接種培養(yǎng) 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞 洗 滌 37度消化 ， 檢查是否充分和完全 。 二 、 工程細(xì)胞的獲得與保存 目前用于制藥的動物細(xì)胞有 4類 ， 即原代細(xì)胞系 、 二倍體細(xì)胞系 、 異倍體細(xì)胞系和融合的或重組的工程細(xì)胞系 。 非貼壁依賴性細(xì)胞：生長不依賴于固體支持物表面 ， 可在培養(yǎng)液中懸浮生長 ， 有時被稱為懸浮細(xì)胞 。 物理 、 化學(xué)或生物因素也能獲得 。 根據(jù)細(xì)胞的傳代次數(shù)和壽命 ， 可分為有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系 。 傳代細(xì)胞 : 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞 。 雖然成熟細(xì)胞不能再分化 ， 但其細(xì)胞核仍然具有全能性 ，因此可以通過核移植 ， 克隆動物 。 這些細(xì)胞都是由受精卵分裂產(chǎn)生的細(xì)胞后代生長增殖分化而來 。 細(xì)胞相互接觸匯合成片 ， 接觸抑制 ， 限制分裂和運動 ， 密度不再增加 。 對連續(xù)細(xì)胞系，失去了細(xì)胞周期控制，人工培養(yǎng)條件不適，細(xì)胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡。 使用時按一定比例稀釋 ， 配制成工作液 。 谷氨酰胺溶液中很不穩(wěn)定 ， 要單獨配制成濃縮液 。 含葡萄糖的 BSS過濾除菌 ， 不含葡萄糖時常規(guī)高壓滅菌 。 3） 在另一容器中用 % NaHCO3數(shù)滴溶解酚紅 。 有各種不同成分的生理鹽水 ， 分別加入 pH緩沖劑與指示劑 、 葡萄糖 ， 形成平衡鹽溶液 。 3. 生理鹽水與平衡鹽溶液 在緩沖液的基礎(chǔ)上 ， 添加調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類 ， 在一定程度上能滿足細(xì)胞對 pH和鹽離子要求 。 碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用外 ， 還有間接作用 ， 碳酸生成揮發(fā)性 CO2后很快逸出 。 原代細(xì)胞 pH要求嚴(yán)格 ， 而傳代細(xì)胞要求較寬 。 水存放時間不宜超過 2周 。 無血清培養(yǎng)基通常需要添加激素與生長因子 、 結(jié)合蛋白 、貼壁與伸展因子 、 低分子營養(yǎng)成分等 。 由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同 ， 所用合成培養(yǎng)基也不同 ，在動物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用培養(yǎng)基有 7－ 8種 。 營養(yǎng)價值高 ， 成分復(fù)雜 ， 不穩(wěn)定 ， 來源受到限制 ， 不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用 。 其他附加成分如核苷類及丙酮酸鹽等是培養(yǎng)基的必需成分 ， 有助于細(xì)胞克隆和特異化細(xì)胞的培養(yǎng) 。 血清和水解酪蛋白應(yīng)用于許多細(xì)胞系和原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng) 。 目前停留在流加谷氨酰胺上 。 抗生素 作用對象 工作濃度 （ μg/ml） 穩(wěn)定性 （ 天 ） 兩性霉素 B 真菌 1～ 3 制霉菌素 真菌 50 3 氨芐青霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 紅霉素 G＋ 細(xì)菌 ， 支原體 100 3 四環(huán)素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 10 4 慶大霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 ， 支原體 50 5 利福平 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 50 3 卡那霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 5 鏈霉素 G＋ 、 G－ 細(xì)菌 100 3 氯霉素 G－ 細(xì)菌 5 5 青霉素 G G＋ 細(xì)菌 100 3 三 、 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成 動物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高 ， 不同細(xì)胞系的要求也不盡相同 ， 因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴 。 雖然對使用抗生素仍存在質(zhì)疑 ， 但還是常添加抗生素 ， 以避免輕度污染 。 生長基質(zhì)為胞外基質(zhì)成分 ， 多聚賴氨酸 、 纖維連接蛋白 、膠原 、 層黏蛋白 、 韌黏素等 。 在開放體系中 ， CO2逸出 ， 使培養(yǎng)基變堿 。 人血液 pH維持 。 有時充以 N2氣稀釋 O2濃度 。 哺乳動物細(xì)胞的耐受溫度范圍較窄 ， 在 3537℃ 內(nèi)能正常進行代謝和生長 ， 超出范圍會引起細(xì)胞傷害甚至死亡 。 離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液 。 1） 水是一種良好的溶媒 ， 營養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收 ， 廢物在水中被排泄 。 其它激素有促卵泡激素 、 甲狀腺素 、 乳激素 、 生育酚等 。 6. 生長類因子及激素 細(xì)胞之間是相互聯(lián)系的 ， 而非孤立的 。 Ca2＋ 、 Mg2＋ ， 對細(xì)胞間的互黏穩(wěn)定起重要作用 。 維生素 K， 促進合成凝血酶原 ， 促進血液凝固 。 脂溶性維生素包括維生素 A、 D、 E、 K四種 。 3. 維生素 維生素是一類微量的小分子有機生物活性物質(zhì) ， 對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用 。 氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?， 間接提供能量 。 培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖 ， 有時添加核糖等 。 選擇劑 基因 使用濃度 氨甲喋呤 dhfr－ ～ 300 μmol/L 氨喋呤 tk＋ μmol/L 5溴脫氧尿苷 tk－ 30 μg/ml G418, Zeocin neo 100～ 800 μg/ml 潮霉素 B hyg 10～ 400 μg/ml 殺瘟稻菌素 bsd 2～ 10 μg/ml 霉酚酸 gpt 25 μg/ml 嘌呤霉素 乙?；D(zhuǎn)移酶 ～ 10 μg/ml XylA ada 4 μmol/L 報告基因 特點 使用與分析方法 cat 內(nèi)源活性低 ， 蛋白穩(wěn)定 ， 線性范圍窄 ， 體外 ， 熒光或免疫分析 lacZ 有內(nèi)源活性 ， Xgal染色 ， 線性范圍寬 體內(nèi)外 ， 染色 ， 比色 、化學(xué)發(fā)光或熒光分析 堿性磷酸酶 分泌型 ， 線性范圍寬 ，受到細(xì)胞類型限制 體外 ， 比色 、 化學(xué)發(fā)光或熒光分析 gus 蛋白質(zhì)穩(wěn)定 ， 線性范圍寬 ， XGluc染色 體內(nèi)外 ， 染色 ， 比色 、化學(xué)發(fā)光或熒光分析 gfp 無內(nèi)源活性 ， 分子量小 ，穩(wěn)定 ， 無需底物 ， 紫外線激發(fā) 體內(nèi)外 ， 熒光分析 第三節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備 動物細(xì)胞離體后 ， 失去了消化等系統(tǒng) ， 不能利用多糖 、蛋白質(zhì)等聚合程度高的化合物 。 為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系 ， 先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24～ 48小時 ， 讓細(xì)胞倍增 1～ 2代 ， 使轉(zhuǎn)染 DNA表達(dá) 。 滲透性休克和 DMSO等化學(xué)試劑能促進 DNA進入細(xì)胞?；?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多 ， 主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染 、 物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 。 抗機械剪切 ， 能在無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長 。 GH3用于生長激素研究， 293細(xì)胞系用于基因治療的研究。已有突變細(xì)胞系能用無血清培養(yǎng)。 NSO和 SP2/O－ Ag14不分泌 Ig， 與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤 ， 分泌制備特異性抗體 。 C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細(xì)胞 ， 貼壁型生長 。 使用氨甲酰喋呤 ， 增加外源基因的拷貝數(shù) ， 提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平 。 貼壁型生長細(xì)胞 ， 但可進行懸浮培養(yǎng) ，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力 。 貼壁生長 ， 對很多病毒敏感 ， 廣泛用于疫苗生產(chǎn) 。 表達(dá) IgM， 懸浮生長 。