培訓(xùn)講義-修改后-wenkub.com
2025-04-13 22:38 本頁面
【正文】 新接種的瓶子做好標(biāo)記，放到光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。重復(fù)漂洗三次。1. 紫薯藤條的表面消毒：將溫室中剪下的紫薯藤條用自來水洗凈，并用吸水紙吸干（超凈工作臺(tái)外操作）。用鑷子固定住葉片，用手術(shù)刀小心把主葉脈去除。每瓶接種4~6段。每升培養(yǎng)基可以倒20瓶/皿。 超凈工作臺(tái)消毒把超凈工作臺(tái)內(nèi)的干熱滅菌器電源打開（如果不用，則不用打開），把培養(yǎng)瓶/皿（或培養(yǎng)基）放入超凈臺(tái)內(nèi)，打開超凈臺(tái)紫外燈，消毒20~30min?！静僮鞑襟E】（一） 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 培養(yǎng)基滅菌 把高壓蒸汽滅菌鍋電源接通，確認(rèn)鍋內(nèi)的水處于高水位；把培養(yǎng)基以及所有需要滅菌的試劑放入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，設(shè)定滅菌時(shí)間（20min）、溫度（121℃），打開氣閥，開始滅菌。調(diào)好pH值后，加入8g 瓊脂粉，用封口膜封號(hào)瓶口，等待滅菌。待其溶解后，定容到1L，并用1N NaOH和1N 。 器具：移液器（吸頭）、鑷子、手術(shù)剪、手術(shù)刀（刀柄、刀片）?！局参锊牧稀?紫花苜蓿無菌苗。無菌操作：在整個(gè)操作的進(jìn)行過程中，材料所處的環(huán)境、所使用的試劑、器皿、器具都是無菌的，這樣的操作過程稱為無菌操作。Cl10. 胰RNA酶（20μg/mL）2μL胰RNA酶原液 + 1mL TE，分裝七、 質(zhì)粒的酶切鑒定【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 按如下表所示向離心管中添加藥品：10uL的反應(yīng)體系20uL的反應(yīng)體系10x buffer 1uL限制性內(nèi)切酶 DNA ddH2O 8ul10x buffer 2uL限制性內(nèi)切酶 1uLDNA 1uLddH2O 16ul2. 37℃（或其他酶的最適溫度）孵育14小時(shí)。Cl 1mL + EDTA ，加dH2O定容至100mL。B、2%SDS（50mL）：稱取2g SDS，dH2O定容至100mL。）3. I號(hào)液（100mL） 、 1M Tris2H2O ，加入800mL重蒸水，磁力攪拌器攪拌，加入NaOH調(diào)至pH ，用重蒸水定容至1L。Cl緩沖液（1L）pH Tris溶于800mL水中，攪拌條件下加入濃鹽酸（pH 70mL；pH ，pH ），溶液冷卻至室溫，加入重蒸水至總體積1L，分裝，高壓滅菌。8. 向上清中加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的3M NaAc（pH ），混勻后，冰浴10分鐘，4℃/12000rpm 離心5min，棄上清，倒置離心管于濾紙上。該過程動(dòng)作務(wù)必輕柔。吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥?！局饕噭?．10x TBE 電泳緩沖液 ，20mL （），加水定容至100mL 2．6x 上樣緩沖液 %溴酚藍(lán)，%二甲苯青FF，15%聚蔗糖水溶液，室溫保存。雙手均衡用力取下梳子，動(dòng)作要慢；5. TBE 倒入電泳槽中，約超過膠面1cm（開始可略少，以便于點(diǎn)樣）；6. 取一塊封口膜，將溴酚藍(lán)點(diǎn)于其上，取5uL待點(diǎn)樣品同溴酚藍(lán)混勻。3. 反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性60s，55℃退火30s，74℃延伸2min，共30循環(huán)，最后72℃延伸10min。4. 根據(jù)質(zhì)?？剐郧闆r，吸取50~200ul菌液涂布于添加了對(duì)應(yīng)抗生素的平板上。質(zhì)粒一般1ul足以，連接產(chǎn)物為5~10ul，最都不要超過20ul否則反而影響轉(zhuǎn)化效果。分裝細(xì)胞，此細(xì)胞即為感受態(tài)細(xì)胞，可直接轉(zhuǎn)化或70℃保存。將離心管倒置于濾紙上1min。二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 挑取一個(gè)單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃/200rpm 培養(yǎng)過夜。 Rif50（50mg/ml）稱取5g利福平，溶于100ml水中。 Amp50（50mg/ml）稱取5g氨芐青霉素，溶于100ml水中。使用接種環(huán)（或槍頭）在凍存管中粘取菌液，左手將倒好的LB平板在酒精燈火焰旁打開，接種環(huán)（或槍頭）在平板表面至少作三次“之”字形劃線。融化已滅好菌的LB固體培養(yǎng)基，室溫涼至50~60℃，根據(jù)質(zhì)粒及菌種的特性加入相應(yīng)的抗生素（如：Amp、Kan、Spe、Rif等），搖勻。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌實(shí)驗(yàn)一、大腸桿菌細(xì)胞的活化【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 配制LB培養(yǎng)基（液體和固體）高溫滅菌（120℃滅菌20min）。4. 提取過程盡量帶手套和口罩。【注意事項(xiàng)】1. 所有藥品都應(yīng)用DEPC水來配制。%凝膠28ml：（1） 瓊脂糖， DEPC水，微波爐熔化；（2）冷卻至50—60℃，加入37%，EB 2ul（用于轉(zhuǎn)膜可以不加），混勻；（3） 倒膠，室溫放置30min以上，使膠徹底凝固；（4）RNA變性體系RNA 5X 甲醛凝膠電泳緩沖液 甲醛 甲酰胺 混勻，65℃15分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍離心。【RNA甲醛電泳】試劑配制5X甲醛凝膠電泳緩沖液：（pH—）40mmol/L 乙酸鈉5mmol/L EDTA （pH—）注： MOPS溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉溶液（用DEPC處理），（pH—）再加經(jīng)用
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