【正文】 化學修飾的專一性YYYXYYYX親和修飾劑： ① 與 S結構相似 ，與活性中心的氨基酸殘基 親和力大，而與活性中心以外的氨基酸 殘基親和力小。先加 S或競 Ⅰ 加共價修飾劑 透析除去 S或競 Ⅰ 活性不喪失 差別標記：底物或抑制劑存在 活性基團不與修飾劑作用去除底物或抑制劑 原來被保護的基團帶同位素標記 可直接得到蛋白質發(fā)揮功能作用的必需基團。 ： 根據所用修飾試劑不同，分為 1)非專一性化學修飾 用非專一性的修飾試劑與氨基酸側鏈基團作用 。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。金屬離子 ： Ca2+、 Mg2+和 Zn2+等高價陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。靜電相互作用 （ electrostatic interaction）： 又稱離子鍵、鹽鍵、鹽橋，是正負電荷間的作用力。附 1 酶的穩(wěn)定性 1）共價鍵 ： 肽鍵 （ peptide bond） —— 穩(wěn)定蛋白質和酶主鏈的核心力量。216。胸腺嘧啶核苷激酶 底物專一性 盒式誘變β半乳糖苷酶 底物專一性 DNA改組綠色熒光蛋白 熒光 DNA改組核酶 底物專一性 易錯 PCR/DNA改組天冬氨酸酶 活性與穩(wěn)定性 隨機 /定位誘變藥物和疫苗 活性 /專一性 /最佳表達 DNA改組酶的體外定向進化應用實例酶的體外定向進化應用實例回本章目錄定向進化與自然進化的異同點216。酶的篩選（小結）l 比色和熒光檢測為代表的高通量篩選方法得到了廣泛的應用，是當前酶的高通量篩選的主要研究和發(fā)展方向。紅外檢測技術是一種新穎的有發(fā)展前途的高通量篩選技術，它不需要生色基團或熒光基團的加入，避免了比色和熒光檢測方法的局限性，但是這種技術目前還無法進行定量，只能檢測催化活性較高的酶，對酶活的進一步研究還需借助傳統(tǒng)方法，方法本身還需要進一步的發(fā)展和完善。 pH指示劑顯色技術被廣泛地用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的篩選l Quick E法通過 pH指示劑的顯色反應監(jiān)測互為對映體底物的水解速率，根據水解速率的差異來評價酶的立體選擇性?；诒壬ê蜔晒鈾z測的高通量篩選顯色或熒光底物的高通量篩選l 大部分熒光和顯色底物都 帶高酸度的苯酚或苯胺離去基團 ，當前廣泛應用的是以硝基苯和傘形酮衍生物作為底物的檢測方法。這種篩選可以在檢測平板中進行，也可以在微孔滴定板中進行，借助一些檢測儀器很容易實現高通量篩選。o 選擇培養(yǎng)基篩選法o 通過添加或減少某種成分使目的菌株獲得生長優(yōu)勢，而其它菌株的生長受到抑制，通過多次的篩選分離最終得到目的菌株。定向進化的選擇策略定向進化的選擇策略定向進化中，突變具有隨機性，但通過 選擇特定方向的選擇特定方向的突變限定了進化趨勢突變限定了進化趨勢 ，加之控制實驗條件，限定突變種類， 降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。體外隨機引發(fā)重組 體外隨機引發(fā)重組(random priming in vitro rebination, RPR)以 單鏈 DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產生大量互補于模板不同位點的短 DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短 DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的 PCR反應中，它們 互為引物 進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。DNA改組和外顯子改組216。 易錯 PCR（ error prone PCR）是指在擴增目的基因的同時引入 堿基錯配 ，導致目的基因隨機突變。是一種簡化的 DNA提出了一種有效的新方法216。 隨機引發(fā)重組 (RPR)shuffling)：由美國 Stemmer前者是人為引發(fā)的，后者雖相當于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的隨機突變的策略216。 人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對基因進行 隨機突變，從一個或多個已經存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經過基因的突變和重組，構建一個人工突變酶庫，通過一定的 篩選或選擇 方法最終獲得預先期望的 具有某些特性的進化酶 。Ala73S— 半衰期93上升 114h 1993年 ,美國科學家 Arnold F H首先提出酶分子的定向進化的概念，并用于天然酶的改造或構建新的非天然酶?；钚?53％；o Ser236位于橫貫枯草蛋白酶 E的 α螺旋末端，遠離催化活性中心，引入 Ser236Cys,可能會形成分子間二硫鍵，有利于提高酶的穩(wěn)定性。o 最適 pH：大部分酶經化學修飾后，酶的最適 pH發(fā)生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。 o 抗原性 ：比較公認的是 PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。定點突變技術，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。 o 現在常用的氨基酸置換修飾的方法是 定點突變技術 。它可以是單體酶，也可以是寡聚酶或更復雜的多酶體系。3 有利于活性中心與底物結合并形成準確的催化部位，酶活力提高。(4) 酶蛋白主鏈修飾 (肽鏈有限水解修飾 )o 利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結構及其空間結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。++ 烷基化修飾劑： 碘乙酸RX 水溶性碳化二亞胺3)胍基的化學修飾來源： Arg修飾反應：本質上是羰基對氨基?；？啥繙y定酶分子中羧基的數目。+(NO2)3CHHII2＋ o 可被還原的側鏈基團 ： 二硫鍵。 烷基化反應 2) 酰基化反應o 試劑特點：o 含有 結構，作用于側鏈基團上的親核基團，使之?；?。 o 經常被修飾的殘基是： n 親核的 Ser、 Cys、 Met、 Thr、 Lys、 His n 親電的 Tyr、 Trpo 對催化活性基團可以通過選擇性修飾側鏈成分來實現氨基酸的取代。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。它們的側鏈基團不同，修飾方法也有所區(qū)別。酶 半衰期 相 對穩(wěn) 定性 天然 SOD 6 min 1 右旋糖 酐 SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量 )–SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量 )–SOD 24 h 240 聚乙二醇 SOD 35 h 350大分子結合修飾的作用：(1)通過修飾提高酶活力 :：(2)通過修飾可以增強酶的穩(wěn)定性：(3)通過修飾降低或消除酶蛋白的抗原性：(3) 酶分子的側鏈基團修飾o 采用一定的方法（一般為化學法）使酶蛋白的側鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。 o 修飾 ：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、 pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。例如，聚乙二醇（ PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（ Ficoll）、葡聚糖、環(huán)