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β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化畢業(yè)論文-wenkub.com

2024-08-28 16:23 本頁面
   

【正文】 分配效應(yīng)使得底物或其他各種效應(yīng)物在微環(huán)境與大環(huán)境之間不均勻分布,從而影響酶反應(yīng)速度,實驗測定的是大環(huán)境的濃度,而反應(yīng)本質(zhì)行為的是微環(huán)境中的濃度。通常基質(zhì)溶于連續(xù)相水中,固定化酶第 4 章 酶的固定化 30 懸浮于其中,以單基質(zhì)反應(yīng)為例 (S—P),基質(zhì) S 從反應(yīng)液主體傳遞到固定化酶微粒外表面,然后擴散到粒子的酶分子上,而生成物 P 則剛好與此途徑相反。在 pH6 或 pH7 時,固定化酶活力迅速下降,可能是過酸或過堿的環(huán)境使酶的活性中心部位基團發(fā)生了不東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 29 可逆的變化 。 起初取 1%, 2%, 3%, 4%, 5%戊二醛作為交聯(lián)劑,反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)溶液無顯著變色現(xiàn)象,表明高濃度的戊二醛將導(dǎo)致酶活力下降,這可能是因為酶分子活性基團被戊二醛過多地修飾,遂分別取 %, %, %, %的戊二醛作為交聯(lián)劑,將 lmL 酶液和海藻酸鈉混合液滴入由 10mL CaCl2溶液和 l0mL 戊二醛溶液組成的混合溶液中,反應(yīng) 15min,結(jié)果見圖 464,從中可見戊二醛濃度在 %時聯(lián)合固定化酶的活力最高,交聯(lián)劑濃度過高時, 使酶本身變性失活,酶活力下降。當(dāng)固定化時間為 0 時,珠體破碎溶解,無法測酶活,最終確定固定化時間為 。 01 2 3 4 5 6海藻酸鈉濃度(%)吸光值 圖 461 海藻酸鈉濃度對固定化酶酶活的影響 CaCl2 濃度的確定 分別配置 濃度 為 1%, 2%, 3%, 4%, 5%的 CaCl2溶液各 20mL 置于 燒杯 中,在相同條件下用 4%海藻酸鈉進行酶固定化處理,固定時間為 1h,固定化酶與底物精確反應(yīng) 10min,加入 Na2CO3溶液中止反應(yīng) , 測吸光值,結(jié)果見 462。 4%, 5%的海藻酸鈉,各取 5mL,放置于 5個燒杯中,每個燒杯中各加入 5mL 酶液,混勻靜置 30min,用注射器吸取 lmL混合液逐滴滴入 20mL 2%的 CaCl2溶液中,于室溫下固定 30min,用蒸餾水洗滌,抽濾三次,獲得固定化酶。本文以海藻酸鈉為包埋載體,戊二醛為交聯(lián)劑,對乳糖酶進行固定化嘗試,探討了固定化的最適條件及固定化酶的部分性質(zhì)。反應(yīng)動力學(xué)參數(shù) Ea、 Km 變大, Vmax 變小。李緒淵等人將來自鷹嘴豆 B 一半乳糖苷酶固定在聚丙烯酰胺上,活力回收率為 72%。 Millert 根據(jù)乳糖酶與乳糖分子的大小不同,牛奶先經(jīng)過超濾,濾過液 (主要是乳糖 )與乳糖酶在反應(yīng)器中反應(yīng),然后再經(jīng)過一次超濾,乳糖、葡萄糖、半乳糖等小分子物質(zhì)通過,而大分子的乳糖酶被截流住,重新回到反應(yīng)器中繼續(xù)循環(huán)使用,第二次的濾過液和第一次的濾 過液混合,就制成低乳糖牛奶。 用纖維素包埋酵母乳糖酶已有工業(yè)規(guī)模應(yīng)用,用其間歇處理預(yù)先超高溫消毒的牛奶。 Tomoska 和 Gemeiner(1995)選用聚乙烯亞胺和戊二醛活化的果 膠酸鈣 (CPG)和海藻酸鈣 (CAG)作載體固定克魯維酵母屬 Marxianus CCYeSY2。固定化酶的特性幾乎與游離酶相同,在巴氏消毒牛奶中 65℃ 固定化酶的半衰期為 450 小時,體現(xiàn)了工業(yè)用于生產(chǎn)低乳糖牛奶的前第 4 章 酶的固定化 24 景。 圖 434 中空纖維反應(yīng)器 固定化乳糖酶國內(nèi)外研究進展 國外研究進展 美國、日本、意大利等國對固定化 β半乳糖苷酶分解乳糖進行了廣泛的研究。另一種方式是把酶保留在纖維的外側(cè) ,而底物則流經(jīng)纖維內(nèi)腔。它可以提供較大的催化表面,結(jié)構(gòu)類似于列管換熱器。底物以一定的流速從下向上流過,使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進行反應(yīng),這時的固定化顆粒和流體可以看作是均勻混合的流體。它具有單位體積的催化劑負(fù)荷高、結(jié)構(gòu)簡單、容易放大、剪切力小、催化效率高等優(yōu)點。此外還可將載有酶的圓片聚合物,固定在攪拌軸上或者將固定化酶放置在與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動的金屬網(wǎng)筐內(nèi),這樣既能保證反應(yīng)液攪拌均勻,同時又不致?lián)p壞固定化酶。表 42 第 4 章 酶的固定化 20 為各種酶的固定化方法比較: 表 42 固定化方法及優(yōu)劣比較 方法 優(yōu)點 缺點 吸附法 制作條件溫和、簡便、成本低、可再生、可反復(fù)利用 結(jié)合力弱,對 pH、離子強度、溫度等因素敏感,酶易脫落,酶的裝載容量較小 包埋法 包埋材料、包埋方法可選擇余地大,固定 化酶的使用面廣,包埋條件溫和 僅可用于低分子量的底物,不適用于柱系統(tǒng),常有擴散限制問題 共價法 載體與歐聯(lián)方法可選擇性大;酶的結(jié)合力強,非常穩(wěn)定 偶聯(lián)條件激烈,易引起酶失活,成本高,某些偶聯(lián)試劑有一定毒性 交聯(lián)法 可用的交聯(lián)試劑多,技術(shù)簡易,酶的結(jié)合力強,穩(wěn)定性高 交聯(lián)條件激烈,機械性差 固定化酶反應(yīng)器的類型 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器 (Continuous Flow Stirred Tand Reactor,CSTR) 該反應(yīng)器內(nèi)裝有攪拌器,能使反應(yīng)組分與固定化酶顆?;旌暇?,如圖 431所示 。與共價結(jié)合法一樣,由于酶的功能團 (如氨基、巰基和咪唑基 )參與反應(yīng)可能引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變,使酶活力下降。 吸附法 通過非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異吸附作用將酶固定到載體 (如硅藻土、陶瓷、塑料等 )表面,方法簡便,酶活力不受影響,但是吸附的靜電作用力容易受到反應(yīng)液中 pH 的影響。與游離酶相比,固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時,又克服了游離酶的不足之處,呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點。便于運輸和貯存,有利于自動化生產(chǎn)。固定化酶技術(shù)是把從生物體內(nèi)提取 出來的酶,用人工方法固定在特定的載體上。而且酶往往在溶液中進行反應(yīng),反應(yīng)以后會殘留在溶液系統(tǒng)中不易回收,造成最終產(chǎn)品生化分離提純操作上的麻煩。 表 38 金屬離子對酶活性影響 試劑 相對酶活 100% 1mmol/L 10mmol/L 100mmol/L 空白對照 Fe3+ nd Fe2+ K+ Na+ Mn2+ Mn2+ Ca2+ nd Zn2+ nd nd Cu2+ nd nd nd 注: nd 表示酶的相對活性低于 5%,可忽略不計。 0204060801001204 10 15 20 25 30 35 37 40 50 60 70溫度℃相對酶活100% 圖 371 溫度對酶活的影響 0204060801001200 1 2 3 4 5t/h相對酶活100%30℃40℃50℃圖 372 溫度對酶的穩(wěn)定性的影響 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 17 不同金屬離子及離子濃度對 β半乳糖苷酶的影響 同金屬離子及離子濃度對 β半乳糖苷酶的影響結(jié)果如表 38 所示。 β半乳糖苷酶 37℃ 保溫 24 h 后仍有 80%的活力。 020040060080010001 2 3 接種量%酶活 圖 35 接種量對產(chǎn)酶能力的影響 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 15 pH 對酶活性和穩(wěn)定性的影響 pH 值對酶催化反應(yīng)的影響分別為影響酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物效率以及酶的穩(wěn)定性。所以,在以下試驗,培養(yǎng)時間均設(shè)定為 24 h 時取樣。因此,以下試驗均采用單菌落培養(yǎng) 10 h 的菌液作為種子菌液。 根據(jù)菌種的生理生化特點,初步判斷其為枯草芽孢桿菌。 第 3 章 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 12 第 3 章 β半乳糖苷酶 酶學(xué) 性質(zhì) 高產(chǎn) β半乳糖苷酶細(xì)菌的篩選 用土壤為 樣本, 以乳糖為唯一碳源,篩選出乳糖利用菌株。將 β半乳糖苷酶在上述緩沖液中 37℃ 保溫 2 h 和 24h 后,測殘留的酶活力,分析 pH 值對 β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響 將種子菌液以 2%的比例接種到裝有 30 mL基 礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中.在 37℃ 、 225 r/min的條件下培養(yǎng),分別于 0、 1 1 2 3 4 60 h取樣,每個處理重復(fù) 3次,測定生物量和 酶活性并繪制曲線。每個處理重復(fù) 3次。取 7 支試管分別吸取 0, , , , , , , , , , , , , , 5mmol/ml ONP,補上述緩沖液至 ,然后 40℃ 保溫 15min,加入 2mL , 1mol/LNaCO3,以第一管為空白,于 420nm 測 定吸光度,以 ONP 的量為橫坐標(biāo),以 A420 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 β半乳糖苷酶粗酶液制備 將純化菌株按體積分?jǐn)?shù)為 1%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中, 37℃ 靜置培養(yǎng) 24h。 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 9 產(chǎn) β半乳糖苷酶菌的篩選 菌株篩選方法 取土樣,稀釋 10 倍,置于 80℃ 水浴鍋中加熱 30min,以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。同時用于孕酮、皮質(zhì)醇半抗原標(biāo)記,初步建立了該酶的液相競爭測定程序。該法簡便快捷,費用低廉,第 1 章 緒 論 7 又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用,適合于在食品工業(yè)上進行應(yīng)用 [12]。 在乳味面包中的應(yīng)用 在乳味面包制作中,添加 β半乳糖苷酶 水解乳,能夠增加面包甜度,提高酵母菌產(chǎn)氣量,使面包更加膨脹,而且水解乳中的半乳糖有利于褐變,改善面包色澤。 在乳清加工中的應(yīng)用 乳清中含有乳清蛋白、乳糖、 礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分,其中乳清蛋白是完全蛋白質(zhì)。 提高乳制品的甜度 乳糖的甜度較低,只有蔗糖 的 20%,水解后,一分子乳糖 生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖,可以明顯提高乳制品的甜度,減少甜味劑的用量,而且不增加食品的熱量 [8]。 β半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 解決乳糖不耐癥患者的乳品消費問題 牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素,尤其是牛乳中含有豐富 的鈣質(zhì),且極易被人體吸收,被譽為 “ 近乎完善的食物 ” 。 等人發(fā)現(xiàn),米曲霉產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶即使在 45℃ 高溫下貯藏 6 個月,仍能保存其活力的 %。酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶最適 pH 近于中性,與牛乳的天然 pH 值 接近 ,最適溫度較低, 適于 處理牛 乳和甜乳清中的乳糖。細(xì)菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶是 胞內(nèi)酶 ,在培養(yǎng)過程中不能分泌到培養(yǎng)基中,它 的耐熱性較高,這一點有利于固定化酶的制造。 東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 4 β半乳糖苷酶的來源及其特性 β半乳糖苷酶存在于植物(尤其是杏、桃、蘋果),細(xì)菌(大腸桿菌、乳酸菌等),真菌(米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母等),放線菌以及哺乳動物(特別是嬰兒)的 腸道中。國 外已有一 些 大公司生產(chǎn)商業(yè)用乳糖酶制劑,用于生產(chǎn)乳糖水解乳制品。 1985 年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的萬賢生對 β半乳糖苷酶在乳清中的綜合利用展開了研究。 進入 80 年代,Jrodon 等 [4]首次對小鼠成功的獲得了動物基因轉(zhuǎn)移,是純合子動物分泌的乳汁中完全不含乳糖,為利用基因工程生產(chǎn)低乳糖牛乳奠定了基礎(chǔ)。 1944 年 Whitter[1]就比較全面的討論了 β半乳糖苷酶的應(yīng)用。這些都為產(chǎn) β半乳糖苷酶的開發(fā)利用提供了潛在的發(fā)展市場。因此,乳酸菌可以廣泛用于各種乳品加工生產(chǎn)低乳糖制品。常見的去除乳糖的方法有大豆配方和水解配方,然而大豆配方對于體重小于 的早產(chǎn)兒其營養(yǎng)成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,因此開發(fā)可以分解乳糖的酶或微生物以水解配方解決乳糖不耐癥的方法成為研究的主要方向。但是由于乳糖不耐癥的存在,很多人難以食用牛奶或其他乳制品,這極大地抑制了乳品行業(yè)的發(fā)展。乳糖酶缺乏癥人群的乳糖攝入量超過其胃腸消化能力時,就會導(dǎo)致乳糖代謝不完全。其結(jié)構(gòu)基因為 LacZ(半乳糖苷酶 ),與 LacY(半乳糖苷透性酶)和 LacA(半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶)共同組成乳糖操縱子,并在特異的乳糖操縱系統(tǒng)中的阻遏物、操縱基因、啟動子等的協(xié)同下,支配調(diào)節(jié) β半乳糖苷酶的合成。 .............................................11 不同金屬離子 及離子濃度對 β半乳糖苷酶的影響。但固定化酶珠體機械強度較差,尚待改進。 以海藻酸鈉 為栽體、戊二醛為交聯(lián) 劑, 對乳糖酶進行固定化。摘 要 I 摘 要 從土壤中篩選出一株產(chǎn) β半乳糖苷酶的枯草芽孢桿菌,并對菌株和其產(chǎn)生的β半乳糖苷酶進行了測定。研究了海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、戊二醛濃度、固定化時間對酶固定化的影響,并對固定化酶酶促反應(yīng)的最適 pH、溫度等進行了測定。 關(guān)鍵 詞 : β半乳糖苷酶 酶活性 酶的固定化Absract II Absract A strain isolated from soil in producing βgalactosidase of Bacillus subtilis, and strains and βgalactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best ino
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