【正文】 3 操作方法 待測酶液的制備 取發(fā)酵液的濾液用 醋酸鈉緩沖液適當稀釋，供測定用。 VVNN 2 11 ??碘的摩爾濃度 式中 N1：硫代硫酸鈉的濃度 (mol/L) V1：消耗硫代硫酸鈉的毫升數(shù) V：碘液毫升數(shù) 稱取 4g 氫氧化鈉 (NaOH)加蒸餾水溶解，定容至 1000ml。本溶液需每月標定一次。在暗處放置 10min 后用蒸餾水 250ml 稀釋，用此液滴定至近終點時，加淀粉指示液 3ml，繼續(xù)滴 定至藍色消失而顯亮綠色。 。上述緩沖液應以酸度計或精密試紙校正 pH。 （ 2）當用不同產(chǎn)品的酪蛋白對同一蛋白酶測定時，其結果會有差異，故蛋白酶活力表示時應注明所用酪蛋白的生產(chǎn)廠。 4 計算 蛋白酶活力單位定義：在 40℃， 下，每分鐘水解酪蛋白釋放 1 微克酪氨酸的酶量定義為 1 個蛋白酶單位。分別吸取 1ml 清液，加 碳酸鈉溶液，最后加入 1ml 福林 酚試劑，搖勻，于 40℃水浴中顯色 20min。將濾液稀釋一定倍數(shù) (使其測定光密度在 ~ 范圍內為宜 )。搖勻置于水浴鍋中， 40℃保溫發(fā)色20min，在于波長 660nm處測定吸光度。 3350 酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應加弄乳酸 2~3 滴濕潤。 2%酪蛋白溶液 稱取干酪素 2g 加入 (必要時用小火加熱煮沸 )，然后用 乳酸 乳酸鈉緩沖 液定容至 1000mI 即成。 稱取無水碳酸鈉 (Na2CO3)，定容至 1000m1。冷卻后，定溶至 1000ml。 2H2O)100g，鎢酸鈉(NaMoO4178。用碳酸鈉堿化，再加入福林試劑使之發(fā)色，用分光光度計或光電比色計測定。 (4)滴定至終點藍色褪去之后，就不應再滴定，因四甲基藍指示劑被還原褪色后，當接觸空氣時，又會被氧化重現(xiàn)籃色。平行測定的滴定毫升數(shù)相差不應超過 ，故在標定、預備、正式測定過程中，實驗條件應力求一致。 定糖 預備試驗：吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加入 V1毫升試樣稀釋液 (含葡萄糖量約為 5~15 毫克 )及適量的 %標準葡萄糖溶液，搖勻，以下同標定時操作，總耗糖量為 V2 毫升。 Cu2O+K4Fe(CN)6+H2O=K2Cu2Fe(CN)6+2KOH (淡黃色 ) 2 試劑 斐林試劑 甲液：稱取 35g 硫酸銅， 次甲基藍，用水溶解并定容至 1000ml。加 2 滴 1％次甲基藍溶液，繼續(xù)用水解糖液滴定至藍色消失，此滴定操作需在 1 分鐘內完成。 斐林試劑的校正 吸取斐林試劑甲、乙液各 5 毫升，置入 250 毫升三角瓶中，加 20 毫升水，并從滴定管中加入約 24 毫升 ％標準葡萄糖溶液 (其量應控制在后滴定時消耗 ％標準葡萄糖溶液在 1 毫升以內 )，搖勻，于電爐上加熱至沸，并保持微沸 2 分鐘。加 l00毫升 2%鹽酸溶液，輕輕搖動三角瓶，使試樣充分濕潤。 20％氫氧化鈉溶液 稱取 200 克氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至 1000 毫升。 15H2O)，用水溶解并稀釋至 1000 毫升，如有不溶物可用濾紙過濾。甲液為硫酸銅溶液，乙液為氫氧化鈉與酒石酸鉀鈉溶液。對生產(chǎn)過程中的水分快速測定，可采用更高溫度下干燥 (如 120140℃ )或紅外燈下干燥，以縮短分析時間。在此條件下失去的重量不僅是水分，還有微量的揮發(fā)性物質。 水分測定方法一般采用烘干法，即在 100105℃烘箱中直接干燥。 3 實驗室提供條件 大米、二級麥芽，高溫淀粉酶，啤酒釀造復合酶，細菌中性蛋白酶。直至碘液呈純黃色，不變色，糖化結束； 在 10~15 分鐘內急速冷卻到室溫； 沖洗攪拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其內容物準確稱量為 450 克； 用玻棒攪動糖化杯，并注于漏斗中進行過濾； 收集約 100 ml 濾液后，將濾液返回重濾。 P [ %(m/m)] ； Z —— 啤酒的真正濃度，176。 所得結果表示至一位小數(shù)。 P [％ (m/m)] 。 P) 或 %(m/m)表示。 或用已知質量的蒸發(fā)皿稱取試樣 ，精確至 ，于沸水浴上蒸發(fā)， 直至原體積的 1/3，取下冷卻，加水恢復至原質量，混勻。 或用儀器法直接自動測定、計算、打印出樣品的真正濃度及原麥汁濃度。所得結果應表示至兩位小數(shù)。 (注意 保存蒸餾后的殘液，供做真正濃度用 )。 根據(jù)相對密度 2020d 查附錄 A，得到餾出液的酒精度， %(V/V)或 g/100mL。 )℃的恒溫水浴中，待內容物溫度達 20℃，并保持 5min不變后取出。 ℃； 容量瓶： 100mL ； 移液管： 100 mL ； 分析天平，感量 ； 天平：感量 ； 附溫度計密度瓶： 25mL 或 50mL； 數(shù)字密度計和注射器。 6 允許差 同一試樣兩次測定值之差，不得超過平均值的 4％。用水清洗電極， 并用濾紙吸干附著電極的液珠。 4 分析步驟 試樣的處理：取試樣（ ）約 60mL 于 100mL 燒杯中，置于 (40177。 ，附電磁攪拌器 ； 恒溫水?。壕?77。 5 分析結果的表述 試樣中雙乙酰含量按式 (2)計算： ??AX ???????????????????????(2) 式中： X —— 試樣中雙乙酰的含量， mg/L ； A335 —— 試樣在 335nm波長下，用 20mm比色皿測得的吸光度； —— 吸光度與雙乙酰含量的換算系數(shù)。通汽預熱后，置 25mL容量瓶于冷凝器出口接受餾出液，外加冰浴冷卻，加 2～ 4 滴消泡劑于 100mL 量筒中，再注入未經(jīng)除氣的預先冷至 5℃左右的酒樣 100mL，迅速移入已預熱的蒸餾器內，并用少量水沖洗帶塞漏斗，蓋塞。 2 儀器 帶有加熱套管的雙乙酰蒸餾器 ； 具有錐形瓶 (或平底蒸餾燒瓶 )的蒸汽發(fā)生瓶： 2020mL(或 3000mL) ； 容量瓶： 25 mL ； 紫外分光光度計：備有 10mm石英比色皿或 20mm玻璃比色皿。 n 1000179。 計算 游離的α 氨基氮（毫克 /升麥芽汁） =2179。 標準甘氨酸溶液稀釋液：取 標準溶液，在 100ml 的容量瓶中稀釋到刻度。 b 稀釋溶液： 2 克碘酸鉀溶于 600ml 水中，再加入 96%乙醇 400ml. c 標準溶液：溶 甘氨酸于 100ml 水中， 0℃貯藏。 n 或 總還原糖（麥芽糖， g/100g 浸出物）＝ 式中： f—— 斐林溶液系數(shù) n—— 稀釋倍數(shù) G—— 麥芽汁中浸出物含量（ %） D—— 麥芽 汁 20℃比重 注意事項： （ 1） 本測定的操作條件必須嚴格控制，加熱時間、滴定速度每次測定都必須一致，由沸騰至滴定完畢必須在 3min 內結束，否則應重做。 5 操作步驟 （ 1）取糖化試驗的麥芽汁，稀釋至 20 倍或更合適的倍數(shù)，使其滴定量在 15～50ml 之間。 （ 4） 30%醋酸溶液 取 無水乙酸，用水定容至 100ml. （ 5） 斐林溶液 A. 硫 酸銅溶液 溶 克硫酸銅于水中，稀釋至 。待碘化鉀溶解后，于暗處放置 10min，加 250ml 水，用 N 硫代硫酸鈉溶液滴定，近終點時加 3ml %淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至溶液由藍色轉變成亮藍綠色。 3 試劑 （ 1） 硫代硫酸鈉標準溶液 配制： 溶 26 克硫代硫酸鈉及 克無水碳酸鈉于 1000ml 水中。另外的方法是將廢棄物直接放入下水道，而付給污水處理廠一定的費用；或廠內自行處理。 Pape 指出最廉價的處理方法是控制堆積量，隨后再予以焚燒，或堆放在廢棄的鹽礦中。 但必需為這些處理付出代價以保證環(huán)境只受到最少的污染。在大規(guī)模的單細胞蛋白質生產(chǎn)過程中，一個年產(chǎn)量 10 萬噸的工廠，將水重復利用，可使水的消耗量降低至每天 10 萬噸。 第十三節(jié) 水的消耗和重復利用 許多發(fā)酵工廠的 水的消耗量很大（見下表）。 Atkinson 和 Mavituna（ 1983）曾提出： 1，乙醇的售價為 220 英鎊 /噸，使用當?shù)氐奶妓衔锷a(chǎn)、培養(yǎng)液中乙醇含量在 7%（ W/V）時，提取產(chǎn)物的費用限于 40 英鎊 /噸 以下； 2，單細胞蛋白質的售價為 300 英鎊噸，以石油為基本底物，轉化產(chǎn)率為 3%（ W/V）時，收集產(chǎn)物的費用限于 100 英鎊噸以下； 3，有機酸或甘油的售價為 700 英鎊 /噸，在碳水化合物培養(yǎng)基中產(chǎn)物濃度為 10%時，提取收集產(chǎn)物的費用限于 300 英鎊 /噸以下。 使用大型轉鼓式過濾機或離心機的工廠，其折舊、投資的回收和維修費用共占總成本 80%以上。 第十二節(jié) 產(chǎn)物提取和收集的成本 雖然對某些過程中產(chǎn)物的提取和收集成本作過討論，但發(fā)表的資料極少。 在抗生素和其他次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中，提取和收集產(chǎn)品階段的費用將成為生產(chǎn)成本中的主要部分。在細胞的生產(chǎn)過程中，有些醇類和有機酸是發(fā)酵時的主要生產(chǎn)成本，其轉化 產(chǎn)量更為重要。對分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵的生產(chǎn)能力可利用 Wang 等的公式作出比較?；盍姷慕臃N物，可以縮短延滯期tL；這也相當于分離得一株生長速度快或高產(chǎn)菌株。生產(chǎn)能力還基于實驗發(fā)酵時數(shù)，加上為下一批發(fā)酵所作的準備時數(shù)。在 ICI 公司所用的公用系統(tǒng)費用只占制造成本的 14%。在瑞典的粗蛋白質生產(chǎn)計劃，估計年產(chǎn) 10 萬噸單細胞蛋白質時，包括通氣攪拌在內的公用系統(tǒng)費用只占生產(chǎn)總成本的 16%（按 1978 年的價格計算）。用碳氫化合物作為底物的發(fā)酵罐的設計更為復雜。他們引用一種抗生素發(fā)酵的例子，如將攪拌的電動機從 745 焦耳放大到1860 焦耳以增加氧的傳遞速率，即可節(jié)約通氣攪拌費用 25%。根據(jù)六十年代的報道，青霉素發(fā)酵時，通氣量為 ~1vvm時，每小時，每 455 升培養(yǎng)基的攪拌成本為 ~ 便士。因而不再需要機械攪拌。為保持發(fā)酵罐內部的正壓，在發(fā)酵開始時，可從另一個發(fā)酵罐中引入經(jīng)過過濾的二氧化碳和氫。按照通氣的情況，可以將發(fā)酵粗略地分為： 厭氧發(fā)酵，即在發(fā)酵時不宜有游離氧存在，如丁醇丙酮發(fā)酵； 發(fā)酵時只需要供應少量氧氣，如乙醇發(fā)酵； 需氧發(fā)酵，發(fā)酵時需要大量氧，如抗生素、乙酸和單細胞 蛋白質發(fā)酵。在單細胞蛋白質生產(chǎn)工廠的投資中，冷卻設備費用約占總投資數(shù)的 10~15%。發(fā)酵過程包括下列加熱和冷卻步驟： 將培養(yǎng)基加熱到 100℃和 100℃以上，然后冷卻到 35℃或更低； 將發(fā)酵罐及其附屬設備加熱滅菌后再冷卻； 發(fā)酵時會產(chǎn)生熱量，必須將這些熱量輸出，即用冷卻處理，使溫度保持在微生物生長的規(guī)定范圍之內； 發(fā)酵結束后，還需加熱將產(chǎn)品中的水分除去。即使過濾介質是可以清洗后重復使用，則還有正常的損耗和破裂而應考慮折舊費用。增加過濾器的截面積，勢必增加投資費用，用低的操作成本，勢必使空氣的表觀速度和壓力下降。 將壓縮空氣通過纖維或顆粒物質的深床過濾，是最普通的空氣除菌方式。 Stark和 Pohler 發(fā)現(xiàn)可以利用壓縮空氣的熱量對空氣進行滅菌。 第七節(jié) 空氣滅菌 供應大量的滅菌空 氣，是需要發(fā)酵時所具有的獨特的問題。如在單細胞蛋白質生產(chǎn)中，它只占制造成本的 414%。但距工業(yè)實踐還有一段距離，而甲烷和甲醇用于大規(guī)模發(fā)酵過程中是十分經(jīng)濟的。甜菜糖、蔗糖和谷物等碳水化合物是大多數(shù)培養(yǎng)基的主要碳源和能源。在核算成本時，必需注意培養(yǎng)基中碳源的消耗量。大量的含固體量較高的液體，如玉米漿和葡萄糖則需要保溫貯存以防止固化，但溫度又不能過高防止分解。天然物料如果是季節(jié)性的，則需要貯存而大大增加了投資費用。 第六節(jié) 培養(yǎng)基 生產(chǎn)培養(yǎng)基的成本，在總成本中占很大比重，可達 3873%（見下表）。在英國的釀造業(yè)中還在使用 50~100 年前的設備。 對一個工廠的使用年限，可以規(guī)劃推算。如采用塔式發(fā)酵罐，其主要優(yōu)點是節(jié)約操作成本，這是由于省略了機械攪拌，減少了冷卻水的耗用量而節(jié)省了電力和冷卻水費用。發(fā)酒瘋的費用占基本建設投資的 2025%。在另外一些釀造廠中，則采用許多個較小的容器以應付不同的啤酒品種的需求變化。在 1979年 ICI 公司第一個供單細胞蛋白質生產(chǎn)用發(fā)酵罐的容積為 1500M3，高 80M，價值 60 萬英鎊。在 1977 年最大的醋酸生產(chǎn)罐容積是 50M3。添置這類設施，必定會增加成本，或干擾發(fā)酵罐內的攪拌效果。發(fā)酵罐的表面積也是與 r2 成比例。在釀造業(yè)中的 n 值， Pratten 認定為 。在改進洗滌劑的生產(chǎn)工藝后，在添加酶，使酶的生產(chǎn)規(guī)模又得到恢復。 要推斷一個化合物擁有市場的時間，即使有專利權的保護也是困難的。單細胞蛋白質的擴大生產(chǎn)前，曾作過類似的嘗試。 1975 年巴西推行以蔗糖作底物生產(chǎn)乙醇的計劃，目 的是減少石油的進口?？股?、甾體、L 型氨基酸、維生素等都屬于高產(chǎn)值 小體積的范疇。例如：乙醇、正丁醇、丙酮、甘油和醋酸。 MacLennan, Hepner 以及 Lawson 和 Sutherlang 在這方面曾作過討論。 有許多公司，如 Cetus 公司， Panlab 公司都聘請有專門技能的專家主持菌種發(fā)展計劃，或改造菌種，使培養(yǎng)物適應工業(yè)上的要求。如果可提高 10%