20xx年醫(yī)學(xué)專題—免疫原和抗血清的制備概要-資料下載頁
2024-11-04 23:06本頁面
【正文】 各個(gè)cell群，就分別是一個(gè)克隆，這種方法稱為克隆化 2.2目的：獲得目的Ab陽性，Ab分泌旺盛(w224。ngsh232。ng)的雜交瘤cell株 2.3克隆化方法：有限稀釋法將融合cell用培養(yǎng)液充分稀釋，直至每 孔只有1個(gè)cell 顯微操作法 瓊脂平板法 細(xì)胞選分代法 2.4再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要檢測Ab多次傳代， 冰凍復(fù)蘇的雜交瘤cell均要再次克隆化,第三十八頁，共四十九頁。,第二節(jié) 制備(zh236。b232。i)McAb的技術(shù)要點(diǎn),一、免疫小鼠： 為防止免疫反應(yīng)不佳或中途死亡，應(yīng)同時(shí)免疫34只小鼠 Ag純 選用與骨髓瘤cell同源的BALB/C小鼠 二、培養(yǎng)骨髓瘤cell： 與待融合脾cell同源 選生長(shēngzhǎng)旺盛，形態(tài)良好，處于對數(shù)生長(shēngzhǎng)期的cell以供融合用 避免cell反祖，用8AG處理cell 切忌過多傳代 三、收集脾cell 分離脾之前，要檢測Ab。采脾，制成懸液 四、采取飼養(yǎng)cell 五、cell融合： 是雜交瘤的中心環(huán)節(jié)，PEG融合,第三十九頁，共四十九頁。,六、檢測Ab Ab檢測結(jié)果 + 陽性cell→克隆化 更換動物，避免無效試驗(yàn) 檢測Ab，一般選用ELISA或RIA（放免(f224。nɡ miǎn)） 目的：找到陽性細(xì)胞株 七、單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng) 八、制備McAb 九、陽性細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 十、McAb的純化 鹽析法粗提 半飽和硫酸銨沉淀 進(jìn)一步純化 根據(jù)McAb性質(zhì)層析 離子交換層析IgG 親和層析IgG、IgM 十一、McAb的鑒定 1.Ig類型測定 2.特異性測定 3.抗體效價(jià)測定 4.決定簇測定 5.親和性測定 K＝K1/K2 K：1091011L/mol,第四十頁，共四十九頁。,第四十一頁，共四十九頁。,二、基因工程(jīyīn gōngch233。ng)抗體：,自80年代起開始了基因工程抗體(genetic engineering antibody)的研究工作。 制備基因工程抗體的基本過程首先是獲得抗體的基因片段，可從B細(xì)胞DNA庫中篩選；用探針從雜交瘤細(xì)胞、免疫脾細(xì)胞的DNA庫中或cDNA庫中篩選，或以PCR法直接擴(kuò)增等。然后將抗體基因片段導(dǎo)入真核細(xì)胞(如雜交瘤細(xì)胞)或原核細(xì)胞(如大腸桿菌(d224。 ch225。nɡ ɡǎn jūn)等)，使之表達(dá)具有功能活性的抗體片段。 目前已獲表達(dá)產(chǎn)物的重組抗體主要有以下幾種類型。,第四十二頁，共四十九頁。,第四十三頁，共四十九頁。,嵌合抗體(chimeric antibody) 將小鼠VH基因與人CH基因(γ1或γ2重蓮)連接后導(dǎo)入骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合重鏈。再將小鼠雜交瘤細(xì)胞的VL與人CL基因相連，轉(zhuǎn)染含嵌合重鏈的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)過篩選，得到能分泌人—鼠嵌合抗體的骨髓瘤細(xì)胞，其所分泌的嵌合抗體與原雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體特異性及親和力相同，但減少(jiǎnshǎo)了其中的鼠源性成分。,第四十四頁，共四十九頁。,基因工程(jīyīn gōngch233。ng)技術(shù)制備McAb,第四十五頁，共四十九頁。,重構(gòu)型抗體(k224。ngtǐ),為進(jìn)一步減少抗體蛋白中鼠源性成分的比例，可將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab段骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA片段(pi224。n du224。n)與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。,第四十六頁，共四十九頁。,單鏈抗體(k224。ngtǐ),將抗體VL羧基端基因序列與VH氨基端基因序列連接成單鏈的抗體V區(qū)基因，將它轉(zhuǎn)入大腸桿菌使之表達(dá)能與抗原結(jié)合的單鏈抗體。 此抗體之優(yōu)點(diǎn)是分子量很小，作為異種蛋白(d224。nb225。i)的免疫原性較弱，用于腫瘤導(dǎo)向治療時(shí)易滲透入實(shí)體瘤內(nèi)部，其缺點(diǎn)是此類抗體無重鏈穩(wěn)定區(qū)，故不能介導(dǎo)抗體的其他效應(yīng)功能。,第四十七頁，共四十九頁。,抗體(k224。ngtǐ)庫：,即用基因克隆技術(shù)將全套抗體(repertoire)重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆(k232。 l243。nɡ)出來，重組到原核表達(dá)載體，通過在大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，篩選特異性的可變區(qū)基因。為第三代抗體，標(biāo)志抗體技術(shù)發(fā)展的質(zhì)的飛躍，從細(xì)胞工程抗體發(fā)展到基因工程抗體。,第四十八頁，共四十九頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),免疫原和抗血清的制備。利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間的具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)被譽(yù)為免疫學(xué)的一次革命，是20世紀(jì)(sh236。j236。)后20年內(nèi)最為重要的生物高技術(shù)之一。這種Ab是均一的，且是單一特異性的?？贵w庫：,第四十九頁，共四十九
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