【正文】 ma〕和血清〔serum〕是最常用(ch225。nɡ y242。nɡ)的生物樣品。,第一百九十五頁，共二百三十六頁。,血樣采集(cǎij237。)后應(yīng)及時別離血漿或血清，最好馬上分析； 短期保存時應(yīng)置于冰箱冷藏室〔4℃〕中。 長期保存時應(yīng)置于冰箱冷凍室 〔20℃〕中。,4. 貯存(zh249。cn),第一百九十六頁，共二百三十六頁。,〔二〕唾液(tu242。y232。),唾液樣品的優(yōu)點(yōudiǎn)： 1. 樣品容易獲得 2. 取樣無損害性 3. 取樣方式易被兒童接受,第一百九十七頁，共二百三十六頁。,〔三〕尿液,體內(nèi)藥物的去除主要是通過尿液排出，藥物可以原型〔母體藥物〕或代謝物及其綴合(zhu236。h233。)物等形式排出。,第一百九十八頁，共二百三十六頁。,尿藥測定主要用于藥物(y224。ow249。)劑量回收研究，尿去除率、生物利用度的研究，或藥物(y224。ow249。)代謝類型確實定。,第一百九十九頁，共二百三十六頁。,尿樣的采集(cǎij237。),測定尿中藥物濃度時應(yīng)采用時間尿，即將一定時間內(nèi)〔如8h 、12h或24h等〕排泄的尿液全部儲存起來，并記錄其體積(tǐjī)，取一局部測定藥物濃度，然后乘以尿量求得排泄總量,第二百頁，共二百三十六頁。,尿樣的保存(bǎocn),采集后應(yīng)立即測定(c232。d236。ng) 不能立即測定時，應(yīng)參加防腐劑(如甲苯、三氯甲烷、濃鹽酸等)置冰箱中保存。 保存時間為24~36h，可置冰箱冷藏室〔4℃〕中，長時間保存時，應(yīng)冷凍〔20℃〕,第二百零一頁，共二百三十六頁。,三 、生物樣品(y224。ngpǐn)分析前處理技術(shù),〔一〕概述(ɡ224。i sh249。),1. 生物樣品的種類 血樣〔去蛋白〕、 唾液〔去除(q249。 ch)黏蛋白〕、尿液〔綴合物水解,第二百零二頁，共二百三十六頁。,2. 被測藥物的性質(zhì) 結(jié)構(gòu)(ji233。g242。u)、藥理性質(zhì)等,3. 測定方法,〔1〕光譜法,第二百零三頁，共二百三十六頁。,〔2〕色譜法 參比方法(fāngfǎ) HPLC、GC、GC—MS、HPLC—MS,第二百零四頁，共二百三十六頁。,〔3〕免疫分析法 有時作為(zu242。w233。i)參比方法 放射免疫分析法〔RIA〕 酶免疫分析法〔EIA〕 熒光免疫分析法〔FIA〕,第二百零五頁，共二百三十六頁。,〔二〕去除(q249。 ch)蛋白質(zhì),測定(c232。d236。ng)血樣時，首先應(yīng)去除蛋白質(zhì),1. 參加與水相混溶的有機溶劑 常用(ch225。nɡ y242。nɡ)的水溶性有機溶劑有：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、四氫呋喃等,第二百零六頁，共二百三十六頁。,2. 參加(jiār249。)中性鹽,常用的中性鹽： 飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等 鹽析方法與有機溶劑提取法并用(b236。nɡ y242。nɡ)時，可提高藥物的回收率,第二百零七頁，共二百三十六頁。,3. 參加(jiār249。)強酸,常用的強酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸鎢酸混合液及5%偏磷酸等 上清液pH為 0～4，在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白(d224。nb225。i)。 為防止對下一步測定的干擾，過量的強酸要除去。,第二百零八頁，共二百三十六頁。,4. 參加(jiār249。)含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑 常用的沉淀劑：CuSO4NaWO4 ZnSO4NaOH,第二百零九頁，共二百三十六頁。,5. 酶解法 優(yōu)點：適用于測定酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢固的藥物。 缺點：不適用于在堿性(jiǎn x236。nɡ)下易水解的藥物。 最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素,第二百一十頁，共二百三十六頁。,〔三〕綴合(zhu236。h233。)物的水解,測定尿液中藥物總量時，首先應(yīng)將綴合物水解。 方法： 1. 酸水解法 2. 酶水解法 適用(sh236。y242。ng)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物,第二百一十一頁，共二百三十六頁。,〔四〕別離(fēnl237。)、純化與濃集,生物樣品(y224。ngpǐn)的分析,樣品的前處理(chǔlǐ)〔別離、純化與濃集〕：,儀器分析,除去大量內(nèi)源性雜質(zhì)； 提取出低濃度的被測藥物； 濃集藥物與代謝物的濃度。,第二百一十二頁，共二百三十六頁。,1. 液—液提取(t237。qǔ)法,多數(shù)(duōsh249。)藥物為親脂性化合物，而大多數(shù)(duōsh249。)內(nèi)源性雜質(zhì)是強極性的水溶性物質(zhì)，因此用有機溶劑提取一次即可除去大局部雜質(zhì)。,第二百一十三頁，共二百三十六頁。,〔1〕常用(ch225。nɡ y242。nɡ)萃取溶劑及萃取方法,①溶劑的選擇 最常用(ch225。nɡ y242。nɡ)乙醚和三氯甲烷,②溶劑(r243。ngj236。)的用量 有機相：水相=1︰1 或2︰1,第二百一十四頁，共二百三十六頁。,③提取的pH 多數(shù)生物樣品在堿性下提取；當(dāng)一些(yīxiē)堿性藥物在堿性條件下不穩(wěn)定時，那么在近中性pH用氯仿和異丙醇提??；中性藥物在pH7附近提取。,④提取次數(shù)(c236。sh249。) 一般只提取一次,第二百一十五頁，共二百三十六頁。,〔2〕 優(yōu)點(yōudiǎn) 〔3〕缺點 〔4〕離子對提取法,第二百一十六頁，共二百三十六頁。,2. 液固提取(t237。qǔ)法〔LSE〕,原理(yu225。nlǐ)——應(yīng)用液相色譜法原理(yu225。nlǐ)處理樣品,第二百一十七頁，共二百三十六頁。,將具有吸附、分配及離子交換(l237。 zǐ jiāo hu224。n)性質(zhì)的、外表積大的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱，以溶劑淋洗后，將生物樣品通過，使藥物或雜質(zhì)保存在擔(dān)體上，用適當(dāng)溶劑洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑將藥物洗脫下來。,第二百一十八頁，共二百三十六頁。,常用擔(dān)體可分為兩類： 第一類為親水性的硅藻土，可以吸附、捕集不同極性的藥物，然后用與水不混溶的有機溶劑洗脫。 第二類常用疏水性(shuǐx236。ng)的活性炭、聚苯乙烯或化學(xué)鍵合相等，可吸附親脂性藥物，然后用有機溶劑別離。,目前(m249。qi225。n)液—固提取最常用的方法是固相萃取〔SPE〕,第二百一十九頁，共二百三十六頁。,優(yōu)點： 1. 引入雜質(zhì)少 2. 提取效率高，可用少量(shǎoli224。ng)生物樣品進(jìn)行分析 3. 不會形成乳化現(xiàn)象 3. 處理樣品速度快 4. 平安、價廉 5. 萃取操作可在室溫進(jìn)行，適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定的藥物。,第二百二十頁，共二百三十六頁。,3. 被測組分(zǔf232。n)的濃集,〔1〕直接吸出適量供分析 尖底試管(sh236。guǎn)，參加小體積的、比重大的有機溶劑,第二百二十一頁，共二百三十六頁。,〔2〕揮去提取(t237。qǔ)溶劑法 氮氣流吹干法：適用于不易揮發(fā)的藥物 減壓法：適用于易揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物,第二百二十二頁，共二百三十六頁。,〔五〕化學(xué)(hu224。xu233。)衍生化,目的 使藥物變成具有能被別離的性質(zhì) 提高檢測(jiǎn c232。)的靈敏度 增強藥物的穩(wěn)定性 提高對光學(xué)異構(gòu)體別離的能力,第二百二十三頁，共二百三十六頁。,能被衍生(yǎn shēnɡ)化的基團： 藥物分子中含活潑H者均可 被化學(xué)衍生化，如含有 COOH、 OH、 NH2， NH、SH 等官能 團的藥物,第二百二十四頁，共二百三十六頁。,GC中的化學(xué)衍生化法 極性基團(jī tu225。n)→ 極性小、易揮發(fā)的藥物 主要的衍生化反響：烷基化，?；?，硅烷化,第二百二十五頁，共二百三十六頁。,HPLC中化學(xué)(hu224。xu233。)衍生化 目的主要是提高藥物的檢測靈 敏度。,化學(xué)衍生化包括： 柱前衍生化法 柱后衍生化法 分析速度快，別離(fēnl237。)好，但儀器設(shè)備較復(fù)雜,第二百二十六頁，共二百三十六頁。,四、生物藥物(y224。ow249。)分析方法驗證,〔一〕準(zhǔn)確度,生物藥物分析的準(zhǔn)確度用加樣回收試驗(sh236。y224。n)衡量。,第二百二十七頁，共二百三十六頁。,附錄?藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原那么?規(guī)定(guīd236。ng)相對回收率一般應(yīng)在85～115%范圍內(nèi)，在LOQ附近應(yīng)在80～120%范圍內(nèi)。,第二百二十八頁，共二百三十六頁。,藥物提取回收率 提取回收率稱為絕對(ju233。du236。)回收率，是指經(jīng)預(yù)處理〔如萃取〕后能將生物樣品中的藥物用于分析的比例，是評價預(yù)處理方案優(yōu)劣的指標(biāo)之一。,第二百二十九頁，共二百三十六頁。,實際分析時，由于生物樣品中的藥物難于做到完全回收，一般只要求提取回收率穩(wěn)定(wěnd236。ng)〔重現(xiàn)性好〕，且≥50%。,第二百三十頁，共二百三十六頁。,〔二〕精密度,生物樣品分析(fēnxī)時，常用RSD表示精密度，并可細(xì)分為批內(nèi)〔或日內(nèi)〕精密度及批間〔或日間〕精密度。,批內(nèi)精密度〔日內(nèi)精密度〕：是同一次測定(c232。d236。ng)的精密度。,第二百三十一頁，共二百三十六頁。,批間精密度〔日間(r236。jiān)精密度〕：是不同次測定的精密度。,附錄?藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)(zhǐdǎo)原那么?規(guī)定一般RSD應(yīng)小于15%，在LOQ附近RSD應(yīng)小于20%。,第二百三十二頁，共二百三十六頁。,〔三〕定量(d236。ngli224。ng)限,〔四〕專屬性〔特異性〕,1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾(gānrǎo) 2. 藥物代謝物的干擾 3. 在臨床藥物監(jiān)測時要同時考慮服用藥物的干擾,第二百三十三頁，共二百三十六頁。,〔五〕線性與范圍 所有生物藥物分析方法都必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)包括一定梯度的5～8個濃度；標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品可能的濃度范圍，對于(du236。y)含量測定要求一般濃度上限為樣品最高濃度的120％，下限為樣品最低濃度的80％〔但應(yīng)高于LOQ〕；標(biāo)準(zhǔn)曲線不包括零點。r≥0.99,第二百三十四頁，共二百三十六頁。,〔六〕樣品穩(wěn)定性 1. 長期貯存(zh249。cn)穩(wěn)定性 2. 短期室溫穩(wěn)定性 3. 冷凍—解凍穩(wěn)定性 4. 貯備液穩(wěn)定性,〔八〕與參比方法測得結(jié)果的相關(guān)程度(ch233。ngd249。)的比較,〔七〕質(zhì)控樣品(y224。ngpǐn),第二百三十五頁，共二百三十六頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),結(jié)構(gòu)。(Ksp=1.5610–10 )。物質(zhì)對單色光吸收強弱與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度關(guān)系定律。熒光激發(fā)光譜〔激發(fā)光譜〕。色譜(s232。 pǔ)柱的理論板數(shù)越多，柱效越高。2. 雜質(zhì)定量檢查或限度檢查。應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結(jié)果。〔1〕常用萃取溶劑及萃取方法?！财摺迟|(zhì)控樣品,第二百三十六頁，共二百三十六頁。,