【正文】 TGFβ）抑制性信號分子Smad 7表達，調(diào)控TGFβSmad信號通路，抑制體外培養(yǎng)靜止期HSC活化，阻斷TGFβ1促靜止期HSC活化效應(yīng)，Tet還誘導(dǎo)活化HSC活化逆轉(zhuǎn)。部分最新研究成果已經(jīng)整理成文發(fā)表在本領(lǐng)域有一定影響力的SCI索引源期刊上，并被SCI收錄(收錄號 IDS Number: 963XN)[2]（相關(guān)文章參詳見申請人簡歷及附件二、三）。這些全新研究成果進一步增強了我們開發(fā)這一傳統(tǒng)中藥的信心。TGFβ1是目前認識的最重要的促肝纖維化因子。抑制TGFβ1對HSC的作用一直以來均是抗肝纖維化重要著眼點[3]。Smad 7是HSC TGFβ信號通路的最主要負反饋調(diào)節(jié)信號分子，上調(diào)Smad 7是抑制TGFβ對HSC不良生物效應(yīng)的有措施之一[4]。在肝纖維化過程中，TGFβ信號通路還與整合素信號通路存在密切聯(lián)系。這表現(xiàn)在三個方面：①XXXXXX。②XXXXXX。③XXXXXXXXX。綜上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可進一步實現(xiàn)XXXXX治療?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們研究室在國家自然科學(xué)基金資助下，過去三年中應(yīng)用化學(xué)方法合成了RGD和M6P，并將RGD與M6P結(jié)合成一新型復(fù)合分子RGDM6P，研究比較了它們對HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（項目名稱：RGD修飾細胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究，編號：30170412）。我們的研究發(fā)現(xiàn)，RGD和RGDM6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGFβ激活同時，還可阻止HSC與ECM結(jié)合，阻斷整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究還發(fā)現(xiàn)，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性，增加其局部濃度，使RGDM6P顯示出較RGD更強的抑制作用[14]。我們首次證實，新型復(fù)合分子RGDM6P用于抗肝纖維化治療，無論在對HSC靶向的特異性，還是多位點聯(lián)合作用方面，都優(yōu)于單一的含RGD序列的肽段或M6P（參見基金結(jié)題摘要，相關(guān)文章參見申請人簡歷及附件四）。RGDM6P新型復(fù)合分子的研制成功及其對HSC靶向與抑制功能的發(fā)現(xiàn)，有助于我們?nèi)パ芯扛嗟腍SC靶向選擇性高、局部作用強、系統(tǒng)毒性小的新型藥物和(或)制劑，從而提高藥物的療效、減輕毒性反應(yīng)。結(jié)合我們對Tet藥理作用的分子機制的研究結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)，XXXXXXXX?；谝陨舷盗醒芯炕A(chǔ)與設(shè)想，緊跟國內(nèi)外在制劑學(xué)方面的進展，我們擬設(shè)計XXXXXXXXXXX。當(dāng)前，受體調(diào)節(jié)藥物靶向（receptormediated drug targeting）作為一種新型的給藥系統(tǒng)受到人們的重視[16]。XXXXXXXXXXXXXXXXX。迄今為止，尚未見到XXXXXXXXXXX。結(jié)合國內(nèi)外同行的研究報道與我們的研究基礎(chǔ)，不難推斷，XXXXXXXXXXXXXXXXX。綜上所述，我們擬在XXXXXXXXXX。本研究將為XXXXXXXX等提供理論與實踐基礎(chǔ)。XXXXXXXXXX可以設(shè)想，如能取得預(yù)期效果，經(jīng)過良好設(shè)計的基礎(chǔ)研究后，這一XXXXXX應(yīng)用于臨床的時間不會太久，前景廣闊。參考文獻 Friedman of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004。1(2): Chen YW, Li DG, Wu JX, et inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factorbeta in vitro via upregulation of Smad Ethnopharmacol 2005。100(3): Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et strategies for the treatment of chronic liver Clin Exp Res 2005。29(11 Suppl): Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in 2003。125(1): Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et integrin alphavbeta3 is a receptor for the latencyassociated peptides of transforming growth factors beta1 and J 2003。369(Pt 2): Annes JP, Chen Y, Munger JS, et alphaVbeta6mediated activation of latent TGFbeta requires the latent TGFbeta binding Cell Biol 2004。165(5): 、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題 ： XXXXX化學(xué)合成與鑒定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成與鑒定。 不同類型脂質(zhì)體的制備、技術(shù)參數(shù)優(yōu)化、物理性質(zhì)鑒定和脂質(zhì)體藥物包封率、載藥量、配體結(jié)合率鑒定與提高。 大鼠HSC分離培養(yǎng)，XXXXXXX 修飾脂質(zhì)體與肝星狀細胞體外結(jié)合活性研究。 XXXXX 修飾XXXXXXXXX 對肝星狀細胞活化、增殖、XXXXXXX信號通路影響。 究。 XXXXXXXX 對膽總管結(jié)扎和CCl4大鼠肝纖維化防治作用。XXXXXXXXX 的藥代動力學(xué)特征、組織分布特征和XXXXXXX ： 研究構(gòu)建XXXXXXXX，為抗肝纖維化藥物新劑型開發(fā)提供新型靶向載體。 研究XXXXXX 對HSC生物活性影響及機制，為中西藥結(jié)合肝纖維化雙靶向、多靶點、協(xié)同治療提供理論基礎(chǔ)。 研究XXXXXXXX 體內(nèi)HSC靶向性及防治實驗性肝纖維化的有效性，為開發(fā)中藥新劑型、提高藥物在靶組織濃度、降低有效劑量、減輕副作用和提高療效提供實踐基礎(chǔ)。 擬解決的關(guān)鍵問題： 高藥物包封率、高配體修飾率的穩(wěn)定XXXXXXXX 制備。放射性計數(shù)法測定XXXXXX 與HSC結(jié)合活性，有效抑制HSC活化的劑量、時間參數(shù)等。 XXXXXX 體內(nèi)HSC靶向性、抗肝纖維化效果比較與評價。擬采取的研究方案及可行性分析 研究方案：第一部分 XXXXX 及XXXXX 合成(1)XXXXXX 合成及鑒定采用我們研究室建立的方法，化學(xué)合成XXXXXX。應(yīng)用XXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（HPLC）、質(zhì)譜等方法鑒定合成產(chǎn)物純度及分子量。反應(yīng)圖（略）(2)XXXXXXXXXXX 采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（HPLC）和質(zhì)譜分析法進物產(chǎn)物純化與鑒定。反應(yīng)圖（略）第二部分 長循環(huán)脂質(zhì)體制備、鑒定與技術(shù)條件優(yōu)化(1)脂質(zhì)體制備采用經(jīng)我們改良的逆相蒸發(fā)法制備。具體方法如下：XXXXXXXXXX。(2)性質(zhì)鑒定XXXXXXXXXXXXXXXX。(3)均勻設(shè)計優(yōu)化處方根據(jù)實驗結(jié)果及文獻，確定影響包封率的主要因素。以包封率為評價指標(biāo)，采用二項逐步回歸計算回歸方程，并進行方差分析，優(yōu)化條件。第三部分 XXXXX修飾長循環(huán)脂質(zhì)體與HSC體外結(jié)合活性 采用兩步膠原酶灌注和密度梯度離心法分離大鼠HSC，選擇靜止態(tài)和激活態(tài)的HSC，接種于6孔板上(105/mL)。待貼壁后，1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)過夜，細胞同步化。(1)配體結(jié)合的濃度效應(yīng)關(guān)系XXXXXXXXXXX。(2)配體結(jié)合的時間效應(yīng)關(guān)系XXXXXXXXXXXX。(3)競爭抑制XXXXXXXXXX。(4)細胞熒光定位、配體表面結(jié)合率與內(nèi)吞率測定XXXXXXXXXX。(5)平衡解離常數(shù)(Kd)和細胞最大結(jié)合位點數(shù)(Bmax)XXXXXXXXXXX。第四部分 XXXXXXX對HSC生物學(xué)特性影響與機制采用酶法分離大鼠HSC。新鮮分離的HSC，體外培養(yǎng)48 h后，作為靜止期HSC用于下游實驗，或培養(yǎng)1 w后消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，作為活化的HSC用于下游實驗。(1)XXXXXXX對HSC活化狀態(tài)影響XXXXXXXXX。(2)XXXXXX對TGFβ1效應(yīng)影響 XXXXXXXXXXXX。(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGFβ受體XXXXXXX 信號通路影響 XXXXXXXXXXXXXX。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1)XXXXXXXX 在肝纖維化大鼠體內(nèi)的器官分布XXXXXXXXXX。(2)XXXXXXX 大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)分布 采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纖維化(1)造模采用膽總管結(jié)扎和CCl4肝纖維化兩種動物模型。(2)分組及處理XXXXXXXXXXXXXX。(3)治療效果檢測主要比較以下指標(biāo)：XXXXXXXXXXXXXXX。技術(shù)路線圖XXXXXXXXXXXXXXX。 立項依據(jù)有堅實的理論與實踐基礎(chǔ)。本研究是參閱大量文獻并結(jié)合自身以往深厚的肝纖維化防治研究基礎(chǔ)，特別是結(jié)合近四年國家自然科學(xué)基金資助研究成果，在XXXX 化學(xué)合成及功能研究、低劑量XXX抗肝纖維化作用和機制的前期工作基礎(chǔ)上，提出的多途徑、互補協(xié)同與靶向治療肝纖維化的新探索。掌握了國內(nèi)外在受體調(diào)節(jié)藥物靶向、低毒性高效中藥新劑型開發(fā)和以HSC的靶標(biāo)的肝纖維化靶向治療中的最新研究動態(tài)，借鑒“雙靶向”干預(yù)的最新研究成果，并與自身實踐相結(jié)合，在理論上、實踐上均有可靠基礎(chǔ)。 相關(guān)實驗技術(shù)成熟，實驗結(jié)果可信。本研究使用的實驗方法、動物模型和生物分子化學(xué)合成等多為國內(nèi)外應(yīng)用多年的經(jīng)典方法，并有自身實踐基礎(chǔ)。本課題組由掌握以上技術(shù)的成員組成，相關(guān)技術(shù)已應(yīng)用于科研工作。 人員配備合理，具有扎實的相關(guān)工作基礎(chǔ)和完善的實驗設(shè)備及技術(shù)支持。申請人長期從事肝纖維化防治研究，先后承擔(dān)包括國家自然基金在內(nèi)的各類科研項目15項，指導(dǎo)或協(xié)助指導(dǎo)博士后、博士生及碩士生70余名。近四年主持了國家自然科學(xué)基金項目“RGD修飾細胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究(編號30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纖維化的實驗研究(編號30170411)”的研究工作，項目組主要成員參與并完成以上研究工作。實驗設(shè)計指導(dǎo)者、熟練技術(shù)人員及輔助人員等各司其職，可保障研究有條不紊的進行。XXXXXXXXX是國家級重點學(xué)科和“211”工程重點建設(shè)學(xué)科的組成單位之一，長期從事肝纖維化防治研究，先后承擔(dān)包括國家自然科學(xué)基金在內(nèi)的各級各類科研項目20余項。本項目的特色與創(chuàng)新之處 本課題首次嘗試利用XXXXXXX構(gòu)建HSC特異性受體調(diào)節(jié)藥物靶向載體。將新型配體人工化學(xué)合成、受體調(diào)節(jié)藥物靶向技術(shù)與新型脂質(zhì)體載藥技術(shù)三者結(jié)合應(yīng)用于肝纖維化防治，有很強的原始創(chuàng)新性。 本課題首次研究XXXXX生物小分子通過XXXXX與中藥粉防己堿相聯(lián)合，多途徑、互補與協(xié)同防治肝纖維化。本課題是利用分子機制指導(dǎo)中西藥聯(lián)合應(yīng)用、構(gòu)建中藥靶向制劑提高療效降低副作用和多途徑協(xié)同作用抗肝纖維化的全新嘗試，是在總結(jié)自身工作基礎(chǔ)上進行的大膽設(shè)想與創(chuàng)新。研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果 研究計劃： 預(yù)期研究成果 獲得快速、有效和大量合成XXXXXXX和高藥物包封率、高配體修飾率的穩(wěn)定XXXXXXXX的技參數(shù)，并合成足量研究相關(guān)產(chǎn)物。 體外研究證實XXXXXXXX。 在體內(nèi)XXXXXXXXX，有效降低有效劑量、提高療效和降低副作用。 研究證實XXXXXXX可成為抗肝纖維化藥物新劑型開發(fā)的有效載體。（二）研究基礎(chǔ)與工作條件 1 研究基礎(chǔ)。自1981年以來，我們研究室長期從事肝纖維化防治研究，先后對鈣拮抗劑、鈣調(diào)蛋白拮抗劑、大黃素、激活素、腎素血管緊張素系統(tǒng)及卵泡抑素等在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用進行了系列的研究，積累了較豐富的理論，掌握了相關(guān)研究技術(shù)。承擔(dān)了包括國家自然科學(xué)基金在內(nèi)的各類科研項目20多項，先后獲省部級以上科技進步獎10項。項目負責(zé)人率先在我國開展鈣拮抗劑尤其是中藥粉防己堿對肝纖維化防治研究，取得豐富的粉防己堿抗肝纖維化基礎(chǔ)和臨床研究成果，在國內(nèi)外期刊發(fā)表相關(guān)論文50余篇，獲省部級以上科技進步獎5項。近兩年，我們在上海市教委基金項目“粉防己堿影響肝星狀細胞活化信號分子研究（編號02BK14）”資助下完成了小劑量粉防己堿抗肝纖維化效果與機制的研究，在國內(nèi)外首次報道小劑量粉防己堿可通過影響TGFβSmads信號通路抑制HSC活化，相關(guān)研究論文被SCI收錄(收錄號 IDS Number: 963XN)。該研究為指導(dǎo)粉防己堿在肝纖維化防治中應(yīng)用有重要價值。（參見申請人簡歷及附件二、三）。近四年來，申請人承擔(dān)并完成了國家自然科學(xué)基金項目“RGD修飾細胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究（編號 30170412）”，化學(xué)合成了RGDM6P，分子克隆構(gòu)建pCIRGDSmad7并成功通過脂質(zhì)體進行基因轉(zhuǎn)染，通過體內(nèi)外實驗觀察了RGDM6P和pCIRGDSmad7的生物學(xué)效應(yīng)。細胞及動物學(xué)實驗均證實pCIRGDSmad7和RGDM6P可減輕ECM沉積，并影響TGFβ1和整合素表達強度和分布。主要研究工作由本項目組成員參與并完成。目前我們正在利用基金很少量結(jié)余款項進行合成RGDM6P修飾SSL的工作。得益于此，他（她）們分別熟練掌握了生物小分子的化學(xué)合成相關(guān)技術(shù)（多肽合成、固相化反應(yīng)、納米技術(shù)、高效分離技術(shù)等）、免疫組織與細胞化學(xué)技術(shù)、RTPCR和定量PCR、蛋白印跡、高效液相分析、質(zhì)譜分析、肝纖維化動物模型及生物信息學(xué)方法等與本課題相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)與方法（相關(guān)論文參見申請人簡歷）。由于以上的工作基礎(chǔ)，我們擁有豐富的生物分子合成經(jīng)驗，成熟的生物分子構(gòu)建技術(shù)和良好的人員與設(shè)備支持。已經(jīng)構(gòu)建成功的RGDM6P及相關(guān)技術(shù)要領(lǐng)，可直接用于本課題。構(gòu)思本課題的重要原因之一是探討解決簡單單一藥物治療中發(fā)現(xiàn)的諸多問題而開展的，密切相關(guān)的細胞學(xué)、動物學(xué)實驗基礎(chǔ)也是本實驗成功的重要保證。工作條件 XXXXXXX設(shè)有校屬的XXX