【導(dǎo)讀】年來我國(guó)職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域令人關(guān)注的問題，但目前關(guān)于該病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，異性臨床治療措施。反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制與抗體和補(bǔ)體無關(guān)，主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷。要介導(dǎo)活化的效應(yīng)性細(xì)胞凋亡，清除激活的外周CTL，下調(diào)免疫應(yīng)答。途徑對(duì)于機(jī)體對(duì)外來抗原進(jìn)行適度的免疫應(yīng)答，維持免疫自穩(wěn)發(fā)揮重要作用。疫過程進(jìn)行嚴(yán)密調(diào)控，以維持免疫自穩(wěn)。因此，TCE藥疹樣皮炎的的發(fā)生可能。一步探討機(jī)體細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)的變化與TCE藥疹樣皮炎的關(guān)系。本研究選擇三組研究對(duì)象，病例組為16例TCE藥疹樣皮炎患者。28例從未接觸過TCE及其他職業(yè)性有害因素的的健康就業(yè)前體檢工人。升高者15例（%）；谷草轉(zhuǎn)氨酶升高者12例（%）。共培養(yǎng)，在各組內(nèi)隨著TCE染毒濃度的增加外周血淋巴細(xì)胞的存活率逐漸降低，TCE接觸對(duì)照體內(nèi)并不存在針對(duì)TCE原形的特異性記憶性淋巴細(xì)胞。組體內(nèi)上述指標(biāo)均在臨床正常參考值范圍內(nèi)。提示TCE藥疹樣皮炎患者體內(nèi)免。處的粘膜損傷有關(guān)。

　　

【正文】 性很大，導(dǎo)致新接觸TCE 的人群居高不下 ；通過降低工 作場(chǎng)所的接觸濃度也不能有效預(yù)防該病的發(fā)生； 因此 ， 該病的 發(fā)病率并不能得到有效的控制。 本研究 針對(duì) TCE藥疹樣皮炎 目前存在的問題， 根據(jù) T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫發(fā)生的機(jī)制， 擬 通過 包括 TCE藥疹樣皮炎病例組、健康的 TCE接觸 工人 對(duì)照組以及非 TCE 接觸對(duì)照組的成組 設(shè)計(jì) 分析 以及 病例入院和 皮疹消退肝功能恢復(fù)時(shí)機(jī)體免疫指標(biāo)的比較分析 ， 探索 TCE藥疹樣皮炎 患者及健康的 TCE接觸工人體內(nèi) 細(xì)胞免疫學(xué) 指標(biāo)的 變化 ，為該病的 臨床 篩檢 和 治療提供理論依據(jù)，并為 進(jìn)一步對(duì) 該病的免疫學(xué)機(jī)制研究提供線索。 19 第一部分 TCE藥 疹樣皮炎 細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)及發(fā)病機(jī)制 研究 TCE 藥疹樣皮炎是由 TCE 和 /或其代謝產(chǎn)物引起的免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)的疾病，其發(fā)生可能受多種因素的影響， 在職業(yè)環(huán)境中，其濃度低于國(guó)家接觸限值時(shí)仍可發(fā)病，因此很難通過控制作業(yè)場(chǎng)所中 TCE 的濃度而減少該病的發(fā)生。 以往對(duì) TCE 藥疹樣皮炎病例的臨床檢查發(fā)現(xiàn)，病例血液中嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多[1314]。越飛 [15]等對(duì) TCE 藥疹樣皮炎的病例淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，病例組外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯升高 ，且病例組 CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值較正常人升高，但無顯著差異。 這些結(jié)果提示 TCE 藥疹樣皮炎可能是細(xì)胞 免疫 介導(dǎo)的接觸性過敏性皮炎（ allergic contact dermatitis， ACD）。 目前關(guān)于該病也缺乏臨床上特異性的 篩檢 指標(biāo)和治療措施，常常是以發(fā)病工人脫離 TCE接觸和對(duì)癥治療為主，因此， 從 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫過程 入手 ， 探索 針對(duì) TCE藥疹樣皮炎的 早期篩檢 指標(biāo)， 為該病的檢測(cè)、診斷 以及評(píng)價(jià)臨床治療效果 具有重要意義。 本部分選擇三組 研究對(duì)象 開展研究，并 按年齡、性別進(jìn)行匹配 。 病例組：選擇深圳市職業(yè)病防治院收治的處于 TCE藥疹樣皮炎早期的患者 16例，所有病例均嚴(yán)格按照《職業(yè)性三氯乙烯 藥疹樣皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》（ GBZ 18520xx）診斷 。 患者在發(fā)病前 均在中國(guó)深圳市 電子廠 或五金制品廠直接從事金屬部件的清洗工作或者患者工作車間 里 含有清洗工作崗位，清洗液的主要成分為 TCE。直接從事清洗工作的工人接觸 TCE 的方式有皮膚和呼吸道接觸，非清洗工人 主要 以呼吸道吸入 方式 接觸 TCE。 在發(fā)病前一個(gè)月所有的病例均無服用任何藥物，排除 由藥物引起的過敏反應(yīng) ；接觸對(duì)照組 ： 選擇 與 TCE 藥疹樣皮炎病例 相同 工廠 相同車間 相同工種 但未發(fā)生 TCE 藥疹樣皮炎的 健康 職業(yè)工人 32 例 （ 32 例接觸對(duì)照工人隨訪期均超過 TCE藥疹樣皮炎的潛 伏期 90天 ） ；非接觸對(duì)照組：選擇健康的從未接觸過 TCE以及其他職業(yè)有害因素的健康就業(yè)前體檢 工人 28例。經(jīng)知情同意，使用調(diào)查表收集 所有研究對(duì)象 個(gè)體人口學(xué)資料、職業(yè)暴露史、個(gè)體既往健康、疾病史。所有研究對(duì)象 均排除 肝病史、 免疫系統(tǒng)疾病史（包括 糖尿病、 哮喘、過敏性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及遺傳性過敏性疾病史 等 ） 。見表 11。 20 表 11 研究對(duì)象基本特征 非接觸對(duì)照組 接觸對(duì)照組 病例組 例數(shù) (個(gè) ) 28 32 16 男 (個(gè) )/女 (個(gè) ) 16/12 20/12 10/6 年齡 (歲 ),中位數(shù) 23 22 （最小值，最大值） (17,43) (18,40) (18,45) 接觸時(shí)間 (天 ),中位數(shù) 0 150 （最小值 ,最大值） (6,1125) (15,62) 21 第一節(jié) TCE藥疹樣皮炎 患者 外周血 淋巴細(xì)胞 抗原 特異性 增殖功能測(cè)定 目前普遍認(rèn)為 TCE引起的藥疹樣皮炎是由 TCE誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫系統(tǒng)參與的接觸性過敏反應(yīng)性疾病， 細(xì)胞免疫反應(yīng)發(fā)生的過程 包括兩個(gè)階段 ： 誘導(dǎo)階段和激發(fā)階段 。 誘導(dǎo)階段是 在外源化學(xué)物（抗原）的刺激下，機(jī)體發(fā)生抗原特異性 淋巴細(xì)胞的活化 ，這些活化的淋巴細(xì)胞再次接觸到相同的抗原時(shí)，會(huì)發(fā)生增殖反應(yīng) ；激發(fā)階段 則 以接觸部位皮膚出現(xiàn)病理組織學(xué)改變?yōu)榻K點(diǎn)。 本節(jié)對(duì) TCE 藥疹樣皮炎病人外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)液中加入不同濃度的 TCE 作為抗原進(jìn)行刺激 ， 觀察淋巴細(xì)胞是否出現(xiàn)抗原特異性增殖反應(yīng)， 評(píng)價(jià) TCE 藥疹樣皮炎病人是否發(fā)生針對(duì) TCE 本身 的抗原特異性免疫應(yīng)答。此將 有助于 了解TCE對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性和特異性增殖作用，并探討 TCE藥疹樣皮炎的發(fā)生 機(jī)制 。 1 材料與方法 主要儀器 KST340型水平離心機(jī)（ sigma公司 ）， CO2培養(yǎng)箱 （ 美國(guó) SHELLAB公司 ），550型 酶標(biāo)儀（ BioRad公司 ） ， U型底細(xì)胞培養(yǎng)板為 Costar公司 。 主要試劑 胎牛血清（ FCS,杭州四季青生物工程有限公司）， RPMI1640培養(yǎng)液 （ HyClone公司） ， TCE（ %， 分析純級(jí)） 、 二甲基亞砜（ DMSO） 、 噻唑蘭（ thiazolyl blue， MTT） (Sigma公司 )，青鏈霉素 （ 上海生物工程有限公司 ） 、淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所） 。 研究對(duì)象 在全部研究對(duì)象中， 外周血淋巴細(xì)胞抗原特異性增殖實(shí)驗(yàn) 獲得 成功 結(jié)果 的 有病例組 工人 11例， 其中男 7例，女 4例，年齡 1829歲，平均 23歲（中位數(shù)） ；接觸對(duì)照組 19例，其中男 13例，女 4例，年齡為 1930歲，平均 22歲 ； 非接觸對(duì)照組 15例，其中男 9例，女 6例，年齡為 1927歲，平均 22歲（中位數(shù)） 。所有研究對(duì)象 在晨起空腹條件下，采集 肘靜脈 肝素 抗凝血 8ml，于 4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行 22 實(shí)驗(yàn)室 檢測(cè) 。 主要試劑的配制 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液： RPMI1640培養(yǎng)液 89ml，加入胎牛血清 10ml，青鏈霉素1ml。 5% TCE：在 1ml離心管中先加入 95?l DMSO，再加入 5?l TCE，吹打幾次，充分混勻。 200?l細(xì)胞懸液中加入 ?l 5% TCE(終濃度即是 5mmol/L)。 1% TCE：在 1ml離心管中先加入 80?l DMSO，再加入 20?l 5% TCE，吹打幾次，充分混勻。 200?l細(xì)胞懸液中加入 ?l 1% TCE(終濃度即是 1mmol/L)。 % TCE：在 1ml離心管中先加入 80?l DMSO，再加入 20?l 1% TCE，吹打幾次，充分混勻。 200?l 細(xì)胞懸液中加入 ?l % TCE(終 濃度即是)。 MTT溶液：取 50mg MTT粉末，在 15ml無菌管中加入 10ml無菌三蒸水溶解，配制成 5mg/ml濃度 的應(yīng)用液。 血液的處理 淋巴細(xì)胞增殖功能的測(cè)定 ， 采用 MTT法 [16]，程序如下： 首先用淋巴細(xì)胞分離液分離研究對(duì)象外周血淋巴細(xì)胞， 用含 10%FCS 的RPMI1640培養(yǎng)液 將細(xì)胞濃度調(diào)整為 2106個(gè) /ml，分別加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每份細(xì)胞懸液分為 DMSO 孔、 、 1 mmol/L、 5 mmol/L，并分別設(shè)置 3個(gè)平行孔 。 各孔加入細(xì)胞懸液 ， 每孔 。 DMSO 孔 為溶劑對(duì)照孔， 加入 微升 DMSO, 、 1 mmol/L、 5 mmol/L孔分別加入相應(yīng)濃度用 DMSO 溶解的 TCE。 置于 5% CO2， 37℃ 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng) 72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前 4小時(shí)每孔加入 10?l MTT（ 5mg/ml） 混勻 ，繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后 1000r/min離心5min，輕輕吸棄上清，每孔加入 DMSO， 吹打混勻， 使 紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀以 490nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值（ A490nm）。 并按照下面公式計(jì)算出 不同TCE染毒濃度 下 淋巴細(xì)胞的相對(duì) 存活率（ %）。 淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率（ %） = TCE孔 A490nm 100% DMSO 孔 A490nm 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 由于資料不符合正態(tài)和方差齊性，因此采用非參數(shù)法。 用 統(tǒng)計(jì)軟 23 件， 三組間比較采用 成組設(shè)計(jì)的多個(gè) 獨(dú)立 樣本比較的秩和檢驗(yàn)（ KruskalWallis 法 ） ， 兩組間 比較用 兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)（ MannWhitney 法 ） 。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，顯著水平設(shè)為 α=。 分析結(jié)果 用中位數(shù)（最小值，最大值）表示 2 結(jié)果 研究對(duì)象外周血淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率（ %） 三 組研究對(duì)象 淋巴細(xì)胞 相對(duì) 存活率 均 隨著 TCE 濃度的增加而 呈 下降 趨勢(shì) ，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （ p） 。但各 相同 染毒 濃度 條件下， 三組研究對(duì)象之間淋巴細(xì)胞的存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ p）。見表 111。 表 111 三組研究對(duì)象不同 TCE濃度染毒情況下淋巴細(xì)胞存活率（ %） DMSO 細(xì)胞存活率 %TCE 細(xì)胞存活率 1%TCE 細(xì)胞存活率 5%TCE 細(xì)胞存活率 病例組 100 (,) * (,) *△ (,) 接觸對(duì)照組 100 (,) * (,) *△ (,) 非接觸對(duì)照組 100 (,) * (,) *△ (,) 注： *表示與 %TCE比較， P。 △ 表示與 1%TCE比較， P。 相同 TCE濃度下，三組之間比較無顯著性差異。 3 討論 T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)發(fā)生的過程涉及到 記憶性 T淋巴細(xì)胞的生成和效應(yīng)性T細(xì)胞的活化增殖， 外來抗原 /半抗原 進(jìn)入機(jī)體后，可刺激 T淋巴細(xì)胞 活化致敏 ，成為針對(duì)某一特定抗原的效應(yīng)性 T細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同的抗原 /半抗原 時(shí)，致敏 T 淋巴細(xì)胞將進(jìn)一步增殖分化，并通過釋放一系列淋巴因子，導(dǎo)致以單核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主的炎癥反應(yīng)。 因此，檢測(cè)淋巴細(xì)胞 抗原特異性 增殖水平是 對(duì)化學(xué)物 細(xì)胞免疫研究和臨床免疫功能檢測(cè)的一種常用方法。 可以檢測(cè)機(jī) 24 體是否對(duì)某一特殊的化學(xué)物致敏。 本研究 中 發(fā)現(xiàn) 在相同 TCE 染毒濃度下 ， 病例組、接觸對(duì)照組以及非接觸對(duì)照組三組之間 淋巴 細(xì)胞 相對(duì) 存活率 未 呈現(xiàn) 顯著 性 差異 （ P） ，提示 經(jīng) TCE處理后的病例組和接觸對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞無明顯的增殖變化， 因此 未檢測(cè)到病例組和接觸對(duì)照組體內(nèi)存在針對(duì) TCE 的特異性 致敏 淋巴細(xì)胞。 推測(cè) 產(chǎn)生以上結(jié)果的原因 有以下幾點(diǎn)：第一， TCE需要 在體內(nèi) 經(jīng)過代謝活化后才能形成半抗原，藥疹樣皮炎的發(fā)生主要是由 TCE的代謝產(chǎn)物而非 TCE本身所引起 ，在體內(nèi) 并 不存在針對(duì) TCE 原形 的抗原特異性致敏淋巴細(xì)胞 。 在體外， 人外周血淋巴細(xì)胞 對(duì)TCE 的代謝能力較弱，產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物的量不足以引起 該類 淋巴細(xì)胞的增殖 。動(dòng)物試驗(yàn)的研究結(jié)果表明 [17]， TCE 致敏豚鼠脾淋巴細(xì)胞與 TCE+S9 共培養(yǎng)后的 淋巴細(xì)胞 存活率高于 TCE（ S9），而正常對(duì)照組豚鼠脾淋巴細(xì)胞與 TCE+S9共培養(yǎng)后的存活率低于 TCE（ S9）， 提示 TCE經(jīng) S9代謝活化后其活性代謝產(chǎn)物才 對(duì)致敏動(dòng)物的淋巴細(xì)胞 產(chǎn)生促 增殖活性 ； 第二， TCE 在體內(nèi)主要在肝臟內(nèi)進(jìn)行代謝，可能與體外淋巴細(xì)胞對(duì) TCE的代謝機(jī)制不同，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同。在體外， TCE不能通過人外周血淋巴細(xì)胞代謝為具有致敏性的代謝產(chǎn)物。 第 三 ，TCE 或其代謝產(chǎn)物 作為小分子化學(xué)物 （分子量 1000） ， 通常認(rèn)為其是作為半抗原與體內(nèi)的某些蛋白分子結(jié)合 形成全抗原后才能發(fā)揮其 免疫學(xué)效應(yīng)， 而 在 體外 ，缺乏這種與 TCE和 /其代謝產(chǎn)物發(fā)生特異性 結(jié)合 的 蛋白，而使得 TCE不能發(fā)揮其免疫學(xué)功能 ； 第 四 ，體外 TCE 對(duì)細(xì)胞的毒性作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其對(duì) 致敏 淋巴細(xì)胞的增殖作用， 而掩蓋了 TCE對(duì)淋巴細(xì)胞的 增殖作用 ，使僅僅檢測(cè)到了細(xì)胞毒作用 。 陳海 燕等 [18]用 SD 大鼠建立 TCE 致敏動(dòng)物模型，并采集心臟血分離單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，結(jié)果表明， TCE 單獨(dú)作用可體外刺激致敏大鼠的單個(gè)核淋巴細(xì)胞的增殖； 另外一項(xiàng)在小鼠中的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， TCE 致敏的小鼠脾淋巴細(xì)胞與 TCE體外共培養(yǎng) 72小時(shí) 后，細(xì)胞存活率與溶劑對(duì)照組相比顯著升高，致敏的小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外再次接觸到半抗原（ TCE）后，發(fā)生半抗原特異性增殖 [19]。 以上兩項(xiàng)研究與本次 研究結(jié)果的不一致性推測(cè)是由于 采用了不同 種屬的動(dòng)物 外周血淋巴細(xì)胞 對(duì) TCE的代謝能力不同 導(dǎo)致。 由此可見， TCE免疫毒效應(yīng)必須結(jié)合 TCE代謝途徑和個(gè)體易感性進(jìn)行綜合分析，其免疫毒效應(yīng)是由 TCE 本身還是由其代謝產(chǎn)物發(fā)揮主要作用，以及是否 25 多種代謝產(chǎn)物的聯(lián)合作用，還需進(jìn)一步研究。尤其是淋巴細(xì)胞抗原特異性增殖試驗(yàn)，需要直接使用 TCE的多種代謝產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)加以鑒定。