【導讀】癌癥嚴重威脅著人類的健康，其發(fā)病率呈上升趨勢?；熥鳛槠涑Ｒ?guī)臨床治療手段，在癌癥治療中具有手術和放射治療不能替代的作用。腫瘤細胞產生多藥耐藥的原因。度表達是導致其產生多藥耐藥的主要原因之一。沉默MDR1基因，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性將為改善癌癥病人的化療效果奠定基礎。的RNA干擾表達載體。，構建靶向mrp1siRNA重組質粒。結果：成功構建靶向MRP1基因。

　　

【正文】 5μL 退火溶液加 45μL 滅菌雙蒸水混勻，使干涉片段終濃度為 8ng/μL。 下面以一對 DNA 片段為例描述干涉片斷退火過程。其退火過程見圖 22： 圖 22 干涉片段的退火 Figure 22 Anneal of DNA fragment 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 17 重組載體的構建 （ 1） 將含有 （含 2μg/mL 氨芐青霉素）的 500mL 三角瓶中，置 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜（置搖床中160r/min）。 （ 2） 實驗前預先配制溶液 Ⅱ ，溶菌酶。預冷溶菌酶、溶液 Ⅰ 和溶液 Ⅲ 。取出菌懸液，觀察菌體生長狀況，將菌懸液分裝于兩個 250ml離心桶中，調平。預冷離心機至 4℃ ，4℃ 下 8000r/min 離心 5min，棄上清，得菌體。 （ 3）加預冷的溶液 Ⅰ 50ml 于每離心桶，混勻，洗滌沉淀。 8000r/min 離心 5min，棄上清，得沉淀。 此步驟的目的為出去培養(yǎng)基， 以獲得更純的細菌沉淀物。 （ 4）用 17ml 溶液 Ⅰ 吹散重懸 細菌沉淀物，加 3ml新配制的溶菌酶溶液，溫和混勻，室溫放置 10min，裂解大腸桿菌。 （ 5）加 40ml 新配制的溶液 Ⅱ ，以使菌體破碎，釋放質粒 DNA 等內容物。緩慢顛倒數(shù)次，防止破壞基因組 DNA，室溫放置 3min。 （ 6）加 30ml 預冷的溶液 Ⅲ ，緩慢顛倒數(shù)次，防止 SDS 破壞基因組 DNA，冰浴放置 15min，使蛋白質沉淀出來。 4℃ 下以 10000r/min 離心 10min，然后將上清液全部倒入新離心桶中。 （ 7）將上清液在 4℃ 下以 10000r/min 離心 10min，然后將上清液經 8 層紗布過濾至新離心桶中，以盡量除去蛋 白質。 （ 8）加 倍體積 （約 54ml） 的異丙醇，充分混勻，室溫放置 15min，以沉淀核酸。 8000r/min 離心 15min，小心倒掉上清，敞開瓶口倒置于紙巾上，使殘余上清液流盡，晾干。 （ 9）加 15ml 水再加 15ml LiCl（預冷）混勻，靜置沉淀 15min， 4℃ 下 10000r/min離心 15min，以出去蛋白質和 RNA。 （ 10）倒上清于新的離心桶中，加 30ml 異丙醇，劇烈 震蕩 ，靜置沉淀 15min，在 4℃下以 10000r/min 離心 15min。 再次沉淀核酸。 （ 11）棄上清，得到沉淀的核酸。敞開瓶口倒 置于紙巾上使殘余上清液流盡。 （ 12）用 70%乙醇洗滌沉淀， 4℃ 下以 10000r/min 離心 5min，棄去乙醇，離心桶敞口倒置于紙巾上，使乙醇揮發(fā)殆盡。 此步驟可以沉淀 DNA。 （ 13）加 2ml 無菌水溶解沉淀，將液體吸到 10ml 離心管中，再吸 2ml ddH2O 沖洗瓶壁，隨后將洗液加到同一 10ml 離心管中，隨后加 100181。l RNaseA， 37℃ ，水浴 30min。以使 RNA 徹底分解。 （ 14）加等體積含 13％（ w/v）聚乙二醇（ PEG 8000）的 ,充分混合， 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 18 用微量離心機于 4℃ 以 120xx 轉 /分，離心 15 分鐘，以回收質粒 DNA。 （ 15）沉淀用 3ml70%乙醇重懸 清洗，以除去 PEG， 120xxr/min 離心 8min。 （ 16）重復上步操作，將離心管倒扣于紙巾上 10min，使乙醇揮發(fā)干凈，加 1ml H2O溶解，用等體積酚 /氯仿 /異戊醇再抽提一次蛋白質，室溫下 8000r/miin 離心 10min。質粒 DNA 溶解于酚相中，中層為蛋白質，下層為氯仿 /異戊醇。 （ 17） 小心吸上清與另一離心管中，加 2 倍體積的預冷無水乙醇，再加 體積的NaAC（ 3mol ， ）以除去酚，冰上沉淀 20min， 4℃ 下 10000r/min 離心 15min，使DNA 沉淀出來。 （ 18） 去上清加入 3ml 70%乙醇重懸清洗， 10000r/min 離心 15min，晾干，用 500181。l無 菌水溶解沉淀。 測量 OD260/280 值及 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。 雙酶切 反應體系如下： （ ） 2μL HindⅢ （ 10U/μL） 1μL BamHI （ 10U/μL） 1μL 10buffer tangoTM with BSA 2μL dd H2O 14μL 反應條件： 37℃ 3h, 80℃ 20min 。 酶切產物的回收純化 酶切產物分別經 1%的 TAE 瓊脂糖凝膠分離后，用 DNA 快速純化回收試劑盒回收純化，按照說明書操作： 試劑盒成分： （ 1） 純化套件（吸附柱 +收集管） ： 50 套 （柱上含有樹脂） 。 （ 2） Buffer B2： 30ml。 （ 3） Wash Solution： 12ml，使用前加入 48ml無水 乙醇，充分混勻。 （ 4） Elution Buffer： 5ml，可以用 TE 緩沖液或無菌水代替。 操作步 驟： （ 1）切取含 DNA 片段的瓊脂糖（ 100mg～ 400mg） 稱重， 按重量比 1： 3（切取重量： Buffer B2 的體積比）加入 Buffer B2。 （ 2） 50℃ 水溶 510 分鐘，膠完全溶化即可，其間可振蕩助溶 23 次，待溶化后將溶液置于 吸附柱 中， 8000g/分 離心 30s，若一次加不完，可分 多 次離心。 （ 3）倒掉液體，加入 500μL Wash Solution 于 吸附柱 中 9000g/分，離心 30s，棄液體。 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 19 （ 4）重復步驟 4。 （ 5） 空吸附柱 9000g/分再次離心 1 分鐘，甩干剩余液體以除去殘余酒精。 （ 6）將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開離心管蓋放置 5～ 10 分鐘，使乙醇揮發(fā)殆盡。 （ 7）加入 15～ 40μL Elution Buffer（ 60℃ 水浴 Elution Buffer 可提高得率 ），靜置 2分鐘。 （ 8） 9000g/分離心 1 分鐘，管底溶液即為雙酶切后質粒載體。 雙切載體與干涉片段的連接 使連接反應體系中雙切載體與干涉片段摩爾比為 1:3，設計反應體系： 負對 照 退火后干涉片段 1μL 1μL 10buffer 1μL 1μL 1μL 雙切 載體 1μL 1μL 1μL dd H2O 5μL 5μL 6μL T4DNA 連接酶 1μL 1μL 1μL 反應條件：混勻后， 16℃ ， 12～ 16h。 注：以下分別將四組干擾片段構建重組質粒標記為 、 。 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 （ 1）從大腸桿菌 JM109 平板上挑取一個單菌落于 3mL LB 試管中， 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。 （ 2）取 菌液 轉接到 LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng) 23h。 (此時， A600 應在 之間，細胞數(shù)務必＜ 108/mL，此為實驗成功的關鍵。 ) （ 3）將菌液轉移到 50mL 離心管中，冰上放置 10min。 （ 4） 4℃ 離心 10min（ 4000r/min）。 （ 5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡。 （ 6）用冰冷的 ，立即放在冰上保溫 30min。 （ 7） 4℃ 離心 10min（ 4000r/min）。 （ 8）倒出上清液，用冰冷的 （務必放冰上）。 （ 9）分裝細 胞，每 200μL 一份，此細胞為感受態(tài)細胞。 [32] 連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞 DH5α （ 1） 從冰箱中取出一管 （分裝 6 管，每管 100μL） 感受態(tài)細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 20 （ 2） 取兩支感受態(tài)細胞懸液，各 加入 5μL 上述連接產物，輕輕搖勻，同時設立轉化陽性對照組（加 1μL pUC19 質粒）和陰性對照組（不加質粒）。 轉化體系如下： 名稱 所加物質 標記 實驗組 1 （ 5μL） A 實驗組 2 （ 5μL） B 空白對照 水（ 1μL） C 陽性對 照 原質粒（ 1μL） D 陰性對照 DH5α（ 1μL） E 自連對照 雙酶切后的質粒（ 1μL） F （ 3） 各組 放置 冰上 30 分鐘 ， 42℃ 水浴中熱擊 90s， 迅速置于冰上冷卻 2min。 （ 4） 向 各 管中加入 1mL LB 液體培養(yǎng)基（不含 Amp），混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1h，保證恢復 細菌正常生長狀態(tài)，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因（ Amp）。 （ 5） 將上述菌液 4000r/min 離心，棄 800μL 上清后?；靹蚝笕?100μL 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置 30 分鐘，待菌液完全被培養(yǎng)基吸 收后倒置培養(yǎng)皿， 37℃培養(yǎng) 1624h（培養(yǎng)箱中）。 、 PCR初步篩選陽性重組子 滅菌牙簽挑取 LB 篩選平板上圓滑單菌落，先在預先分隔并標記的另一 LB 平皿上劃板，然后點入制備好的 PCR 反應混合液，開始擴增。 PCR 反應條件為： 模 板 單菌落 10buffer μL dNTP（ 10mmol/L） μL 正向引物（載體通用引物） μL 反向引物（載體通用引物） μL Taq 酶（ 2U/μL） μL ddH2O μL 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 21 模 板 單菌落 10buffer without MgCl2 μL MgCl2 （ 25 mmol/L） μL dNTP （ ） μL 正向引物（載體通用引物） 1μL 反向引物（載體通用引物） 1μL Taq 酶（ 2U/μL） μL ddH2O μL 94℃ 預變性 2 分鐘； 94℃ 變性 30s， 55℃ 退火 30s， 72℃ 延伸 45s，共 35 個循環(huán)；72℃ 延伸 1 分鐘， 4℃ 保存， ％瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物。劃板的平皿于 37℃培養(yǎng) 1216h。 測序鑒定重組載體 將小提鑒定結果正確的質粒送交上海生工生物工程技術服務有限司，以載體反向引物為測序引物。將經鑒定后未發(fā)生突變的 、 靶向 MRP1 基因 siRNA 重組質粒的宿主菌搖瓶擴大培養(yǎng)后，進行質粒大量提取 ,方法如 所述。 重組質粒大提的 OD值檢測 按照優(yōu)化的堿裂解法大提質粒， 稀釋 50 倍后 利用 Genespec 進行 OD 值檢測 。 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 22 第 3章 結果 與 分析 質粒經 HindⅢ 和 BamHI雙酶切 后膠回收 結果 質粒經 HindⅢ 和 BamHI雙酶切后結果 Ⅲ 和 BamHI 雙酶切結果見圖 33，結果顯示單酶切產物大小約為 6200bp，雙酶切產物略小于單酶切產物，與預期結果相符。 kb marker ； 2. ； 和 BamHI 雙酶切； 4. HindIII 單酶切 圖 33 雙酶切 DNA ladder 。2. Ⅲ and BamHI 4. 6000bp 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 23 目的片段的回收 目的片段回收結果見圖 34 ,結果顯示回收產物大小約為 6Kb，與預期結果相符。 1 2 3 圖 34 膠回收質粒 片段 1kb marker 質粒經 Hind Ⅲ 單酶切產物 回收的雙切產物 Recovery products of linear plasmid 1kb marker Ⅲ Recovery products of plasmid digested by double enzymes 6000bp 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 24 重組載體的菌落 PCR 重組載體菌落 PCR 電泳結果見圖 35，結果顯示 PCR 擴增產物 ,電泳分析發(fā)現(xiàn)陽性產物可以擴增出 560bp 大小的條帶，假陽性產物不能擴增出 560bp 大小的條帶 ,與預期結果相符，可以初步篩選出陽性產物。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 圖 35 重組質粒菌落 PCR 電泳圖 100bp marker； 2均為單菌落 PCR 產物 ,其中 2,5 為陽性產物 bacterial colony PCR screening 500bp 600bp pppppp 齊齊哈爾大學畢業(yè)設計 (論文 ) 25 重組質粒大量提取 重組質粒大量提取后的電泳結果見圖 36，