基因的體外重組和轉(zhuǎn)化-資料下載頁
2025-02-06 19:19本頁面
【正文】 在 32℃ 下培養(yǎng)細(xì)菌時能夠保持溶源性。 但當(dāng)溫度升高到 44℃ —45 ℃ 時，就會導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活， ?DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。（ 3） cI857基因突變的 ?噬菌體 但由于該噬菌體的 S基因上有一個突變，所以細(xì)菌還不裂解。cI857 其它基因溶源狀態(tài)（ ?DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）?DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋白44℃ —45 ℃?DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯合成外殼蛋白32℃?噬菌體 1 外殼蛋白基因 E發(fā)生了無義突變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（ 尾部蛋白 ）。在 cI857基因突變的 ?噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型 ?噬菌體。 （ 4） 互補(bǔ)型噬菌體 外殼蛋白基因 D發(fā)生了無義突變，不能合成頭部的包裝識別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（ 頭部 、尾部蛋白）。?噬菌體 2(5) 體外包裝過程 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每 ?g ?DNA能形成 106噬菌斑）。 （ 6） 轉(zhuǎn)導(dǎo) 74 重組克隆載體導(dǎo)入真核細(xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞二、導(dǎo)入植物細(xì)胞三、導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞外源基因?qū)胝婧思?xì)胞轉(zhuǎn)化率高的菌株； 有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）； 不育的菌株（不會與其他酵母接合）。一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1. 菌株選擇如： ura352, trp1289, leu23, leu2112, his3? 1（ 1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化 2. 酵母的轉(zhuǎn)化方法 酵母 原生質(zhì)球 感受態(tài)酶去壁 CaCl PEG插入外源基因 的酵母載體PEG（聚乙二醇）使 細(xì)胞壁 具有通透性，允許 DNA進(jìn)入。 CaCl2使 細(xì)胞膜 具有通透性，允許 DNA進(jìn)入。 轉(zhuǎn)化n 原生質(zhì)球 (Spheroplast) 指 細(xì)胞壁 未被全部去掉的細(xì)菌細(xì)胞，它呈圓球狀，可以人為地通過溶菌酶或青霉素處理革蘭氏陰性細(xì)菌而獲得。n 該類菌細(xì)胞壁肽聚糖雖被除去，但外壁層中 脂多糖、脂蛋白仍然保留 ，外壁的結(jié)構(gòu)尚存。所以，原生質(zhì)球較之 原生質(zhì)體 對外界環(huán)境具一定抗性，并能在普通培養(yǎng)基上生長。 酵母 插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40% PEG 4000（ 2）利用 Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化葉盤消毒 切取 土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1. 葉盤法（ leaf disk)植物細(xì)胞 原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶 DNA混合入電擊緩沖液電轉(zhuǎn)儀 12kV,325?F電擊愈傷組織 幼苗分化2. 電擊法（ electroporation)又稱 高速微型子彈射擊法（ Highvelocity microprojectiles)DNA ?m鎢彈頭 吸附 特制手槍射擊植物裝入（ gene gun） 基因槍法基因槍法 (Biolisticbombardment)支撐板4. 農(nóng)桿菌（agrobacterium）介導(dǎo)（ 1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞1. 磷酸鈣沉淀法HEPES[4羥乙基哌嗪乙磺酸 。 N(2羥乙基 )哌嗪 N39。2乙烷磺酸]緩沖鹽水 （將 NaCl、 KCl、 、 (glucan or dextran)和 1g HEPES溶解在 90ml的蒸餾水，用 NaOH調(diào)節(jié)至所需 pH值，再用蒸餾水定容至 100ml即可。）與含有氯化鈣和 DNA的溶液緩慢混合，會形成含磷酸鈣和 DNA的沉淀。依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有 10% 的細(xì)胞能吸收 DNA沉淀。（ 2）特點(diǎn)：脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如 Life Technologies）。2. 脂質(zhì)體（ lipofectin）載體法脂類包埋 DNA，通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。直接把外源 DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3. 顯微注射法 (microinjection)二乙氨乙基（ diethylaminoehtyl， DEAE）葡萄糖能促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞攝入外源 DNA。4. DEAE葡萄糖傳染法葡聚糖葡聚糖 +DNA吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分 DNA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。DEAEdextran 細(xì)胞 外源 DNA預(yù)處理 攝入DEAEdextran外源 DNA 細(xì)胞混合DEAEdextran對細(xì)胞有毒 !5. 病毒（ virus）介導(dǎo)外源基因?qū)爰?xì)胞的方法7演講完畢，謝謝觀看！
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1