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2025-09-30 14:54本頁面
【正文】 1. 取出兩塊膜 ， 用濾紙將殘留液體吸凈后 ，將兩塊膜的蛋白面相對(duì)放入封閉液 2. RT， 12hours 或 4℃ 過夜 一抗 1 把膜從冰箱中取出 ， RT ， 30min。 注： 封閉液可回收 2 四個(gè)角蘸點(diǎn)水鋪好保鮮膜后 ， 加 1： 100的一抗500ul（ 抗體稀釋液 495ul+5ul mouse p65抗體 ）于保鮮膜上 3 蛋白面朝下 ， 使尼龍膜和一抗充分接觸 。 注避免產(chǎn)生氣泡 ， 如有氣泡 ， 可用鑷子將膜的四角輕輕提起 ， 排出氣泡 4 蓋上玻璃平皿 ， RT下孵育 2hours 5 TBST 10min 2 ； TBS 10min 1 二 抗 ， 加 1： 1000 的二抗1000ul（ 1ul mouse 抗人 IgGHRP+ 999ul抗體稀釋液 ） ， 要避免產(chǎn)生氣泡 3. 蓋上平皿 ， 同上 RT孵育 2 hours 4. TBST 10min 2 ； TBS 10min 1 顯 色 1 鋪好保鮮膜，分別滴加 5滴發(fā)光試劑 A和 B，混合 1min 2 同上蛋白面朝下放好尼龍膜，要避免產(chǎn)生氣泡。反應(yīng) 1min 3 用鑷子夾起尼龍膜，用濾紙將多余的發(fā)光試劑吸盡，至沒有液體滴下為止 4 將尼龍膜蛋白面朝上置于另外兩塊鋪好的保鮮膜上。用濾紙將膜邊的殘余液體吸凈后，折回保鮮膜，將之放到壓膜用的夾板里 轉(zhuǎn)膜 戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因?yàn)槭稚系挠椭瑫?huì)阻斷轉(zhuǎn)移 濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 以適量的轉(zhuǎn)移 Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜 5min 方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極 排去濾紙、膠和膜間的氣泡 電轉(zhuǎn)時(shí)間： 200mA 12h,轉(zhuǎn)移結(jié)束后， 膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置 （ 3）封閉 5％脫脂奶粉或 3％ BSA （含 ％ Tween20 TBS或 PBS配制） 時(shí)間：室溫 3h或 4186。C 過夜 封閉液回收 顯色 辣根過氧化物酶：底物為 DAB 堿性磷酸酶：底物為 BCIP/NBT 化學(xué)發(fā)光顯影 最常用 ,辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品） 注意： 化學(xué)發(fā)光前將膜用不含 Tween20的 TBS或 PBS洗滌一次曝光的時(shí)間和顯影的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況而定 膜的再利用 Stripping Buffer洗滌后（洗滌 Buffer: 的TrisHCI含 2％ SDS和 100mm的 ? － 2ME ）用不同的一抗進(jìn)行雜交，檢測(cè)其它蛋白的表達(dá)情況。一張膜可以重復(fù)使用 3－ 4次
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