實驗動物胚胎工程技術-資料下載頁
2025-09-11 20:53本頁面
【正文】 注射法是將胚胎干細胞或其他胚細胞注入桑椹胚或囊胚腔中來制作嵌合體動物。 61 將帶有外源基因的體細胞作為供體，通過核移植技術克隆到去核卵母細胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕 動物 的子宮中。出生后 動物的基因型與供體的基因型完全一致。 62 ? 外源基因進入細胞后的命運 外源 DNA進入細胞后有三種命運： 1． 被胞內酶降解 。 2． 以游離狀態(tài)存在 。 游離的未整合外源 DNA只要有真核細胞能識別的 啟動子 、 編碼基因以及 poly(A)信號 等 ， 一般都能得到表達 ， 但隨著細胞衰老 ， 表達力下降 。 這種表達不能傳代 ， 稱為 暫時表達 。 3． 整合到受體細胞染色體 （ 只有少數(shù) ） 。 整合到受體細胞基因組的外源基因 ， 能隨細胞分裂遺傳到子細胞 ， 稱為 穩(wěn)定表達 。 63 DNA構件導入細胞的方法 顯微注射法 逆轉錄病毒感染 精子介導轉基因 電穿孔 電穿孔 脂質體轉染 磷酸鈣轉染 生殖細胞或早期胚胎 ES細胞 體細胞 隨機整合 定點整合或隨機整合 定點整合或 隨機整合 64 外源基因整合到受體細胞染色體可分為以下兩種情況： ① 隨機插入 （ Random insertion） ： 外源基因進入細胞后 ， 隨機插入到任意的染色體內 。 如果插入到一個基因內 ，可能導致該基因的失活 。 另外 ， 插入外源基因受鄰近調控序列的影響 ， 其表達可能高 ， 也可能低 。 ② 定點整合 （ Targeted integration） ： 實現(xiàn)定點整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點整合部位的同源DNA序列 ， 即所謂的 同源臂 （ Homologous arm） 。 當外源基因載體進入細胞后 ， 同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近 ， 通過同源重組 ， 將外源基因載體置換到染色體相應的位置上 ， 實現(xiàn)了定點整合 。 我們把這種技術形象地稱之為 “ 基因打靶 ” 。 65 ? 隨機整合（ Random insertion） 外源基因隨機插入到染色體的任意部位。 插入到致死基因序列內：胚胎死亡 插入到功能基因序列內：基因失活 插入到調控區(qū)下游：外源基因表達增強 /減弱 66 ? 定點整合（ targeted integration） 同義詞：基因打靶（ Gene targeting） 是指將基因組的某一基因序列克隆出來并加以改造，再導入同種細胞內。該基因序列可以與細胞基因組內的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后的基因 置換 到基因組內，實現(xiàn)靶基因敲除、替換或改造。 67 ? 同源重組（ Homologous rebination） 是指發(fā)生在 DNA同源序列之間的重組，其條件是兩條 DNA分子有相同序列部分，并且互相接近。 1 neo tk 3 1 2 3 1 neo 3 載體 基因組 位 點 68 如何在體外篩選定點整合的供體細胞和 ES細胞？ ?采用正負篩選法 正篩選：用 Neor基因（新霉素抗性基因） 殺死沒有 Neor基因的細胞 負篩選：用 tk基因（ HSV胸腺激酶基因） 有 tk基因的細胞可使培養(yǎng)液中 的 Ganc轉變成一種有毒物質使 細胞死亡。 ?對通過正負篩選法篩選存活的細胞進行分子生物學鑒定，篩選出定點整合的細胞。 69 用正負篩選法篩選定點整合細胞 正篩選用 Neor基因： 新霉素抗性基因 當帶有 Neor基因的打靶載體轉染細胞，未整合 Neor基因的細胞被培養(yǎng)液中的 G418（新霉素的衍生物）殺死，而整合到宿主細胞的 Neor基因對培養(yǎng)液中的 G418產生耐藥性，存活下來形成細胞克隆。但是存活的細胞克隆只能證明是整合了 Neor基因，而不能區(qū)分是隨機整合還是定點整合。 正常細胞 細胞死亡 定點整合 細胞存活 隨機插入 細胞存活 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 70 正常細胞 細胞存活 定點整合 細胞存活 隨機插入 細胞死亡 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 GANC培養(yǎng)液 ? 負篩選用 tk基因： HSV胸腺激酶基因 HSVtk+基因產物可使培養(yǎng)液中的 Ganc轉變成一種有毒物質使細胞死亡。如果發(fā)生隨機整合， tk基因的作用是細胞死亡。如果發(fā)生同源重組，由于 tk基因在同源區(qū)之外不能整合，斷裂脫落，因而對細胞沒有影響。 這樣受體細胞抗 G418有正選擇作用，對 Ganc無轉變功能而有負選擇作用，因此認為存活的細胞是與導入基因發(fā)生同源重組的。 71 隨機整合和定點整合的不同點 隨機整合 定點整合 同義詞 隨機插入 基因打靶、同源重組 外源基因構件 無需同源臂，外源基因需啟動子、編碼基因和 polyA信號 需同源臂和正負篩選基因 細胞 受精卵或早期胚胎 ES細胞或體細胞 外源基因導入方法 顯微注射法、逆轉錄病毒法 電穿孔法或脂質體法 插入部位 隨機，無法控制 絕大多數(shù)隨機整合，只有極少數(shù)發(fā)生同源重組 篩選 無法篩選 細胞水平通過正負篩選篩選出定點整合細胞 胚胎移植 直接胚胎移植 須經囊胚內注射或核移植階段再進行胚胎移植 72 復習題 思考題 、體外受精、胚胎分割、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎冷凍保存的基本概念。 ？根據發(fā)育階段，干細胞可分為哪兩類？ iPS? iPS的實際應用意義是什么？ ，細胞核移植包括哪幾種？一般所說的 “ 克隆 ” 是指那一種？ ？ ，什么叫定點整合？ 。
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