實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)-資料下載頁(yè)
2024-09-20 20:53本頁(yè)面
【正文】 注射法是將胚胎干細(xì)胞或其他胚細(xì)胞注入桑椹胚或囊胚腔中來(lái)制作嵌合體動(dòng)物。 61 將帶有外源基因的體細(xì)胞作為供體，通過(guò)核移植技術(shù)克隆到去核卵母細(xì)胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕 動(dòng)物 的子宮中。出生后 動(dòng)物的基因型與供體的基因型完全一致。 62 ? 外源基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn) 外源 DNA進(jìn)入細(xì)胞后有三種命運(yùn)： 1． 被胞內(nèi)酶降解 。 2． 以游離狀態(tài)存在 。 游離的未整合外源 DNA只要有真核細(xì)胞能識(shí)別的 啟動(dòng)子 、 編碼基因以及 poly(A)信號(hào) 等 ， 一般都能得到表達(dá) ， 但隨著細(xì)胞衰老 ， 表達(dá)力下降 。 這種表達(dá)不能傳代 ， 稱(chēng)為 暫時(shí)表達(dá) 。 3． 整合到受體細(xì)胞染色體 （ 只有少數(shù) ） 。 整合到受體細(xì)胞基因組的外源基因 ， 能隨細(xì)胞分裂遺傳到子細(xì)胞 ， 稱(chēng)為 穩(wěn)定表達(dá) 。 63 DNA構(gòu)件導(dǎo)入細(xì)胞的方法 顯微注射法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因 電穿孔 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 生殖細(xì)胞或早期胚胎 ES細(xì)胞 體細(xì)胞 隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合或隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合或 隨機(jī)整合 64 外源基因整合到受體細(xì)胞染色體可分為以下兩種情況： ① 隨機(jī)插入 （ Random insertion） ： 外源基因進(jìn)入細(xì)胞后 ， 隨機(jī)插入到任意的染色體內(nèi) 。 如果插入到一個(gè)基因內(nèi) ，可能導(dǎo)致該基因的失活 。 另外 ， 插入外源基因受鄰近調(diào)控序列的影響 ， 其表達(dá)可能高 ， 也可能低 。 ② 定點(diǎn)整合 （ Targeted integration） ： 實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點(diǎn)整合部位的同源DNA序列 ， 即所謂的 同源臂 （ Homologous arm） 。 當(dāng)外源基因載體進(jìn)入細(xì)胞后 ， 同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近 ， 通過(guò)同源重組 ， 將外源基因載體置換到染色體相應(yīng)的位置上 ， 實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)整合 。 我們把這種技術(shù)形象地稱(chēng)之為 “ 基因打靶 ” 。 65 ? 隨機(jī)整合（ Random insertion） 外源基因隨機(jī)插入到染色體的任意部位。 插入到致死基因序列內(nèi)：胚胎死亡 插入到功能基因序列內(nèi)：基因失活 插入到調(diào)控區(qū)下游：外源基因表達(dá)增強(qiáng) /減弱 66 ? 定點(diǎn)整合（ targeted integration） 同義詞：基因打靶（ Gene targeting） 是指將基因組的某一基因序列克隆出來(lái)并加以改造，再導(dǎo)入同種細(xì)胞內(nèi)。該基因序列可以與細(xì)胞基因組內(nèi)的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后的基因 置換 到基因組內(nèi)，實(shí)現(xiàn)靶基因敲除、替換或改造。 67 ? 同源重組（ Homologous rebination） 是指發(fā)生在 DNA同源序列之間的重組，其條件是兩條 DNA分子有相同序列部分，并且互相接近。 1 neo tk 3 1 2 3 1 neo 3 載體 基因組 位 點(diǎn) 68 如何在體外篩選定點(diǎn)整合的供體細(xì)胞和 ES細(xì)胞？ ?采用正負(fù)篩選法 正篩選：用 Neor基因（新霉素抗性基因） 殺死沒(méi)有 Neor基因的細(xì)胞 負(fù)篩選：用 tk基因（ HSV胸腺激酶基因） 有 tk基因的細(xì)胞可使培養(yǎng)液中 的 Ganc轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使 細(xì)胞死亡。 ?對(duì)通過(guò)正負(fù)篩選法篩選存活的細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，篩選出定點(diǎn)整合的細(xì)胞。 69 用正負(fù)篩選法篩選定點(diǎn)整合細(xì)胞 正篩選用 Neor基因： 新霉素抗性基因 當(dāng)帶有 Neor基因的打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，未整合 Neor基因的細(xì)胞被培養(yǎng)液中的 G418（新霉素的衍生物）殺死，而整合到宿主細(xì)胞的 Neor基因?qū)ε囵B(yǎng)液中的 G418產(chǎn)生耐藥性，存活下來(lái)形成細(xì)胞克隆。但是存活的細(xì)胞克隆只能證明是整合了 Neor基因，而不能區(qū)分是隨機(jī)整合還是定點(diǎn)整合。 正常細(xì)胞 細(xì)胞死亡 定點(diǎn)整合 細(xì)胞存活 隨機(jī)插入 細(xì)胞存活 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 70 正常細(xì)胞 細(xì)胞存活 定點(diǎn)整合 細(xì)胞存活 隨機(jī)插入 細(xì)胞死亡 同源臂 同源臂 Neor Tk基因 GANC培養(yǎng)液 ? 負(fù)篩選用 tk基因： HSV胸腺激酶基因 HSVtk+基因產(chǎn)物可使培養(yǎng)液中的 Ganc轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使細(xì)胞死亡。如果發(fā)生隨機(jī)整合， tk基因的作用是細(xì)胞死亡。如果發(fā)生同源重組，由于 tk基因在同源區(qū)之外不能整合，斷裂脫落，因而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有影響。 這樣受體細(xì)胞抗 G418有正選擇作用，對(duì) Ganc無(wú)轉(zhuǎn)變功能而有負(fù)選擇作用，因此認(rèn)為存活的細(xì)胞是與導(dǎo)入基因發(fā)生同源重組的。 71 隨機(jī)整合和定點(diǎn)整合的不同點(diǎn) 隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合 同義詞 隨機(jī)插入 基因打靶、同源重組 外源基因構(gòu)件 無(wú)需同源臂，外源基因需啟動(dòng)子、編碼基因和 polyA信號(hào) 需同源臂和正負(fù)篩選基因 細(xì)胞 受精卵或早期胚胎 ES細(xì)胞或體細(xì)胞 外源基因?qū)敕椒? 顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法 電穿孔法或脂質(zhì)體法 插入部位 隨機(jī)，無(wú)法控制 絕大多數(shù)隨機(jī)整合，只有極少數(shù)發(fā)生同源重組 篩選 無(wú)法篩選 細(xì)胞水平通過(guò)正負(fù)篩選篩選出定點(diǎn)整合細(xì)胞 胚胎移植 直接胚胎移植 須經(jīng)囊胚內(nèi)注射或核移植階段再進(jìn)行胚胎移植 72 復(fù)習(xí)題 思考題 、體外受精、胚胎分割、胚胎培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎冷凍保存的基本概念。 ？根據(jù)發(fā)育階段，干細(xì)胞可分為哪兩類(lèi)？ iPS? iPS的實(shí)際應(yīng)用意義是什么？ ，細(xì)胞核移植包括哪幾種？一般所說(shuō)的 “ 克隆 ” 是指那一種？ ？ ，什么叫定點(diǎn)整合？ 。
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